Ratones que carecen del PSD | Grupo de latiguillos de Jilin

Scientific Reports volumen 5, Número de artículo: 16410 (2015) Citar este artículo

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La ubiquitinación de proteínas tiene una influencia significativa en diversos aspectos del desarrollo y la función neuronal. Dorfin, también conocida como Rnf19a, es una ligasa de ubiquitina E3 del dedo RING implicada en la esclerosis lateral amiotrófica y la enfermedad de Parkinson, pero no se han explorado sus funciones in vivo. Aquí informamos que Dorfin es un nuevo socio de unión de la proteína de andamiaje postsináptica excitatoria PSD-95. Los ratones mutantes Dorfin (Dorfin-/-) muestran una neurogénesis adulta reducida y una potenciación a largo plazo mejorada en la circunvolución dentada del hipocampo, pero una potenciación a largo plazo normal en la región CA1. Desde el punto de vista del comportamiento, los ratones Dorfin-/- muestran un condicionamiento del miedo contextual deteriorado, pero niveles normales de condicionamiento del miedo con señales, extinción del miedo, aprendizaje y memoria espacial, memoria de reconocimiento de objetos, memoria de trabajo espacial y separación de patrones. Usando un enfoque proteómico, también identificamos una serie de proteínas cuyos niveles de ubiquitinación disminuyen en el cerebro Dorfin-/-. Estos resultados sugieren que Dorfin puede regular la neurogénesis adulta, la plasticidad sináptica y la memoria del miedo contextual.

La ubiquitinación de proteínas regula diversos aspectos del desarrollo y la función neuronal. Las ligasas de ubiquitina E3, que se cuentan por cientos (~400–500 en ratones y humanos), son componentes clave del sistema de ubiquitinación de proteínas y desempeñan funciones importantes en la determinación de la especificidad del sustrato. Se sabe que la ubiquitinación de proteínas conduce a la degradación de proteínas por el proteasoma 26S; sin embargo, la evidencia acumulada indica que también cumple funciones adicionales, como la regulación de la función de la proteína, el tráfico y la localización subcelular, así como las interacciones proteína-proteína.

La ubiquitinación de proteínas en el sistema nervioso regula diferentes etapas del desarrollo neuronal, incluidas la neurogénesis, la migración, la neuritogénesis y la sinaptogénesis1,2,3,4,5. Además, se cree que la ubiquitinación de proteínas sinápticas regula diversos aspectos de la estructura, función y plasticidad sinápticas. Los sustratos conocidos de la ubiquitinación sináptica incluyen proteínas de andamiaje/adaptador, receptores y moléculas de señalización. Los ejemplos específicos y las ligasas E3 relacionadas incluyen PSD-95–Mdm26, GKAP/SAPAP–Trim37,8, Shank/ProSAP7, SPAR–βTRCP9,10, AKAP79/1507, Homer-1a11, CaMKIIα12, liprin-α1–APC/C13,14 , efexina-5–Ube3A15, Arc–Ube3a/Triad3a16,17, receptores AMPA (AMPAR)–Nedd4-1/RNF167/APC/C14,18,19,20,21,22, receptores NMDA (NMDAR)–Mib223, mGluR1α –Siah1A24,25, mGluR5–Siah1A25, receptores GABAA (subunidad γ2)26,27, Munc13-1–Fbxo4528, RIM1–SCRAPPER29 y Piccolo/Bassoon–Siah1A30.

Dorfin, una ubiquitina ligasa E3 del dedo ANULAR, se identificó originalmente como un componente del cuerpo XY de los espermatocitos y los centrosomas31. Dorfin (840 aminoácidos de largo en ratones) contiene dos dominios RING que flanquean el dominio del anillo intermedio (IBR) y dos dominios transmembrana, aunque la topología precisa de la membrana de la proteína no está bien establecida. Estudios previos han implicado a Dorfin en la esclerosis lateral amiotrófica familiar (ELA) y la enfermedad de Parkinson32,33,34,35,36,37,38,39,40. En apoyo de un papel neuroprotector para Dorfin en la ELA, Dorfin ubiquitina la proteína SOD1 mutante (superóxido dismutasa 1) asociada a la ELA33 y, cuando se sobreexpresa en un modelo de ratón de ELA familiar, reduce la cantidad de proteínas SOD1 mutantes y suprime los fenotipos neurológicos y motores. muerte neuronal40. Sin embargo, se sabe poco sobre las funciones de Dorfin en el cerebro normal, incluidas sus interacciones proteína-proteína, las proteínas sustrato y las consecuencias funcionales de la ubiquitinación de la proteína sustrato. Además, las funciones in vivo de Dorfin no se han explorado utilizando enfoques de desactivación de genes.

En el presente estudio, encontramos que Dorfin interactúa con la abundante proteína de andamiaje postsináptica excitatoria PSD-95. Los ratones Dorfin-/- muestran una neurogénesis adulta suprimida y una potenciación a largo plazo (LTP) mejorada en la circunvolución dentada (DG) y un condicionamiento del miedo contextual deteriorado, lo que sugiere que Dorfin es importante para la neurogénesis adulta, la plasticidad sináptica y el aprendizaje y la memoria.

Usando un ensayo de dos híbridos de levadura para seleccionar una biblioteca de ADNc de cerebro de ratón, identificamos a Dorfin/Rnf19a como un socio de unión novedoso de PSD-95. Dorfin contiene dos dominios RING separados por el dominio IBR en la mitad N-terminal seguidos de dos supuestos dominios transmembrana y un motivo de unión al dominio PDZ C-terminal (Fig. 1A). Los últimos siete aminoácidos de Dorfin interactuaron con los dominios PDZ1 y PDZ2, pero no con PDZ3, de PSD-95 (Fig. 1B). Dorfin también interactuó con dominios PDZ de familiares de PSD-95 (PSD-93/Chapsyn-110, SAP97, SAP102), pero no con los de S-SCAM, GRIP2 o Shank1. Un Dorfin mutante, en el que se mutó el último residuo de aminoácido (I840A), no pudo interactuar con PSD-95, lo que indica una interacción PDZ canónica. Estas interacciones PDZ se verificaron mediante ensayos GST-pull down, que mostraron que las proteínas de la familia PSD-95 de longitud completa expresadas en células heterólogas fueron eliminadas por GST-Dorfin, aunque PSD-93 y SAP102 mostraron interacciones más débiles en relación con PSD-95 y SAP97 (Fig. 1C). Los experimentos de coinmunoprecipitación in vitro confirmaron de forma independiente las interacciones dependientes de PDZ de Dorfin con PSD-95 y SAP97 (Fig. 1D,E).

Dorfin interactúa con las proteínas de la familia PSD-95 en ensayos de coinmunoprecipitación, GST pull-down y dos híbridos de levadura.

(A) Estructura de dominio del ratón Dorfin. IBR, ANILLO intermedio; TM, dominio transmembrana; PB, motivo de unión al dominio PDZ. (B) Interacciones de dos híbridos de levadura de Dorfin con PSD-95. Los dominios PDZ de las proteínas de la familia PSD-95, S-SCAM y otras proteínas PDZ en pGAD10 (vector de presa) se analizaron para determinar la unión a Dorfin (aa 834–840; tipo salvaje y el mutante I840A, en el que el último residuo Ile se cambió a Ala) en pBHA (vector de cebo) en ensayos de dos híbridos de levadura. Actividad de β-galactosidasa (β-Gal): +++, <45 min; ++, 45 a 90 minutos; +, 90–240 minutos; −, sin actividad significativa de β-Gal. actividad HIS3: +++, >60%; ++, 30 a 60%; +, 10 a 30%; −, sin crecimiento significativo. (C) Despliegue de proteínas de la familia PSD-95 de longitud completa y controle las proteínas PDZ (S-SCAM y GRIP2) mediante proteínas de fusión GST-Dorfin. Se usó GST-Dorfin (aa 834–840; WT e I840A), o GST solo, para reducir las proteínas indicadas expresadas en células HEK293T, seguido de inmunotransferencia. (D,E) Coinmunoprecipitación de Dorfin con PSD-95 o SAP97. Las células HEK293T doblemente transfectadas con Flag-Dorfin (longitud completa; WT o Δ3 sin los últimos tres residuos aa) y PSD-95, o SAP97, se inmunoprecipitaron (IP) con anticuerpos Flag y se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados.

Para explorar las funciones in vivo de Dorfin, generamos ratones Dorfin-/- utilizando un enfoque de trampa de genes en el que se apuntó al intrón entre los exones 2 y 3 del gen Dorfin (Fig. 2A). El alelo atrapado se verificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de genotipado (Fig. 2B). La PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y la PCR cuantitativa (qPCR) revelaron que el ARNm de Dorfin era indetectable tanto en la corteza como en el hipocampo de los ratones Dorfin-/- (Fig. 2C-E).

Generación de ratones Dorfin-/-.

(A) Diagrama que representa la estructura del gen Dorfin que muestra los exones e intrones y el sitio de inserción de la trampa del gen en el intrón entre el exón 2 y el exón 3. (B) Identificación del gen Dorfin atrapado mediante genotipificación por PCR. (C) Ubicaciones de los cebadores para RT-PCR y qPCR y una sonda para hibridación in situ en el gen Dorfin de ratón. (D,E) Expresión indetectable de ARNm de Dorfin en el cerebro de Dorfin-/- (2 meses) mediante RT-PCR convencional y qPCR. (F) Patrones de distribución de ARNm de Dorfin en secciones de cerebro de ratón WT y Dorfin-/- (2 meses) revelados por hibridación in situ. Regiones CA1 y DG, CA1 y DG del hipocampo. Barra de escala, 1 mm. (G) Patrones de distribución del ARNm de Dorfin en secciones de cerebro de rata WT (3 meses) revelados por hibridación in situ. Cb, cerebelo; CPu, caudado-putamen; Ctx, corteza cerebral; OB, bulbo olfatorio; Hoyo, glándula pituitaria. Barra de escala, 5 mm.

Los experimentos de hibridación in situ en cerebros de tipo salvaje (WT) y Dorfin-/- indicaron que el ARNm de Dorfin se expresa ampliamente en varias regiones del cerebro de ratones WT, incluida la corteza y el hipocampo, mientras que las señales eran casi indetectables en el cerebro Dorfin-/- (Figura 2F). También se observaron señales generalizadas de ARNm de Dorfin en cerebros de rata (Fig. 2G). En particular, las señales de ARNm de Dorfin en el hipocampo fueron más fuertes en la región DG que en la región CA1, especialmente en el cerebro del ratón. Nuestros resultados concuerdan en gran medida con los datos del Allen Brain Atlas (http://www.brain-map.org/) para el ARNm de Dorfin de ratón. A pesar de los repetidos intentos, no pudimos caracterizar los patrones de expresión/distribución de la proteína Dorfin porque faltan los anticuerpos adecuados.

La tinción inmunohistoquímica de cerebros WT y Dorfin-/- utilizando anticuerpos contra NeuN, un marcador neuronal, reveló que los cerebros Dorfin-/- tienen una morfología macroscópica normal en las semanas 4 y 8 posteriores al nacimiento (Fig. 3A, B). Además, un análisis de Sholl de neuronas inyectadas con biocitina indicó que las neuronas principales Dorfin-/- en las regiones DG y CA1 del hipocampo tienen una morfología dendrítica normal (Fig. 3C-G). Los ratones Dorfin-/- crecieron normalmente durante las semanas posnatales 4 a 8, y tanto los machos como las hembras mostraron pesos corporales comparables a los de los ratones WT (Fig. 3H). Además, los análisis de inmunotransferencia de los lisados del hipocampo, la fracción sinaptosómica cruda del hipocampo y los lisados DG microdiseccionados revelaron que los niveles de andamiaje sináptico y proteínas receptoras no fueron diferentes entre los genotipos (Fig. 3I).

Caracterización general de ratones Dorfin-/-.

(A,B) Morfología macroscópica normal del cerebro Dorfin-/- en las semanas 4 y 8 posnatales, según lo determinado por tinción para el marcador neuronal NeuN en secciones coronal y sagital. Barra de escala, 1,0 mm. (C–G) Morfología dendrítica normal de las neuronas principales en las regiones CA1 y DG del hipocampo (2 semanas), como lo demuestra la inyección de biocitina y el análisis de Sholl. Barra de escala, 50 μm. (sem, CA1 basal, n = 6 células de 4 ratones para WT y 7, 5 para KO; CA1 apical, n = 7, 4 para WT y 7, 5 para KO; DG, n = 7, 5 para WT y 6 , 5 por KO). (H) Pesos corporales normales de ratones Dorfin-/- machos y hembras durante las semanas posnatales 4-8. (sem, n = 17 para macho WT, 19 para macho KO, 17 para hembra WT y 14 para hembra KO). (I) Niveles normales de andamiaje sináptico y proteínas receptoras en el hipocampo Dorfin-/- (2-3 meses), como lo demuestra el análisis de inmunotransferencia de lisados hipocampales completos, la fracción hipocampal sinaptosómica cruda (P2) y lisados DG completos microdiseccionados (sem , n = 3–6 para WT y KO).

Debido a que Dorfin interactúa con PSD-95, una abundante proteína de andamiaje sináptico excitatorio, exploramos posibles alteraciones en la transmisión sináptica excitatoria en ratones Dorfin-/-. Las células granulares en la región Dorfin-/- DG mostraron un aumento en la amplitud, pero no en la frecuencia, de las corrientes postsinápticas excitatorias en miniatura (mEPSC) en comparación con las neuronas WT (Fig. 4A). Por el contrario, tanto la frecuencia como la amplitud de las corrientes postsinápticas inhibidoras en miniatura (mIPSC) eran normales en estas neuronas (Fig. 4B). Además, la curva de entrada-salida en las sinapsis de la vía perforante medial de Dorfin-/- en las células granulares DG (sinapsis MPP-DG) fue normal, según lo medido por las pendientes de los EPSP de campo (fEPSP) representados frente a las amplitudes de volea de fibra (Fig. 4C ). Por último, los gráficos de relación de pulsos emparejados contra los intervalos entre estímulos fueron normales (Fig. 4D), lo que sugiere una probabilidad de liberación presináptica inalterada.

LTP mejorada en la región DG, pero no en CA1, del hipocampo Dorfin-/-.

(A) Mayor amplitud, pero frecuencia normal, de mEPSC en células granulares Dorfin-/- DG (P15-17, sem, n = 19 células de 5 ratones para WT y 21, 3 para KO, *p < 0,05, ns, no significativo, prueba t de Student). (B) Frecuencia y amplitud normales de mIPSC en células granulares Dorfin-/- DG (P15-17, sem, n = 17, 4 para WT y 15, 4 para KO, ns, no significativo, prueba t de Student). (C) Curva de entrada-salida normal, determinada mediante el trazado de pendientes de campo EPSP (fEPSP) contra amplitudes de descarga de fibra en sinapsis Dorfin-/- MPP-DG (3 semanas, n = 11 cortes de 4 ratones para WT y 13, 4 para KO ). (D) Proporción de pulso emparejado normal, determinada mediante el trazado de las proporciones de dos pendientes consecutivas de fEPSP frente a los intervalos interestímulo en las sinapsis Dorfin-/- MPP-DG (3 semanas, n = 11 cortes de 4 ratones WT y 13, 4 para KO ). (E) LTP mejorada inducida por cuatro trenes de HFS en sinapsis Dorfin-/- MPP-DG (4 semanas, sem, n = 7 cortes de 4 ratones para WT y 8, 7 para KO, *p < 0,05, t de Student prueba). (F) Proporción normal de NMDA/AMPA en las sinapsis de Dorfin-/- MPP-DG, determinada comparando las pendientes evocadas de fEPSP en los potenciales de retención de -70 (AMPA) y +40 (NMDA) mV (3 semanas, sem, n = 11 células de 6 ratones para WT y 8, 4 para KO, ns, no significativo, prueba t de Student). (G) Frecuencia y amplitud normales de mEPSC en células piramidales Dorfin-/- CA1 (P15-17, sem, n = 14 células de 3 ratones para WT y 11, 3 para KO, ns, no significativo, prueba t de Student) . (H) Frecuencia y amplitud normales de mIPSC en células piramidales Dorfin-/- CA1 (P15-20, sem, n = 11, 3 para WT y 13, 4 para KO, ns, no significativo, prueba t de Student). (J) LTP normal inducida por HFS en las sinapsis Dorfin-/- SC-CA1 (4 semanas, n = 10 cortes de 6 ratones para WT y 8, 5 para KO, ns, no significativo, prueba t de Student).

Curiosamente, la LTP en las sinapsis MPP-DG inducidas por cuatro trenes de estimulación de alta frecuencia (HFS; 100 Hz) mejoró significativamente en ratones Dorfin-/- en comparación con ratones WT (Fig. 4E). Esto no parece ser atribuible a un aumento en la función NMDAR porque la proporción de corrientes mediadas por NMDAR y AMPAR en estas sinapsis no cambió (Fig. 4F), aunque se sabe que LTP en las sinapsis MPP-DG depende de NMDAR41 , 42.

Debido a que la región CA1 del hipocampo también expresa ARNm de Dorfin, aunque en menor medida que la DG, probamos posibles cambios en mE/IPSC y LTP en esta región. Descubrimos que ni los mEPSC ni los mIPSC se alteraron en las neuronas piramidales Dorfin-/- CA1 (Fig. 4G, H). Además, la LTP inducida por HFS (100 Hz) no se alteró en las sinapsis piramidales Dorfin-/- Schaffer colateral-CA1 (SC-CA1) (Fig. 4I). Estos resultados sugieren que la eliminación de Dorfin conduce a una mejora en LTP en las sinapsis MPP-DG, pero no en SC-CA1.

A continuación, exploramos si los ratones Dorfin-/- muestran alguna anomalía en el comportamiento. Los ratones Dorfin-/- exhibieron una mayor actividad locomotora durante la fase de apagado en un entorno familiar, según lo medido por el monitoreo continuo de 48 horas de los movimientos en un entorno familiar en el que los ratones se habían habituado durante 3 días antes de la prueba (Fig. 5A ). Por el contrario, los ratones Dorfin-/- mostraron una locomoción normal en un entorno novedoso, medido mediante la prueba de campo abierto (Fig. 5B), lo que sugiere que los ratones Dorfin-/- son hiperactivos en un entorno familiar, pero no nuevo.

Los ratones Dorfin-/- muestran hiperactividad en un entorno familiar, pero no nuevo, y muestran niveles normales de comportamiento similar a la ansiedad, aseo personal, propensión a las convulsiones, interacción social y coordinación motora.

(A) Los ratones Dorfin-/- muestran una actividad locomotora mejorada en un entorno familiar, según lo medido por el monitoreo continuo de 48 horas de los movimientos del ratón en un entorno familiar promediado en un ciclo de 24 horas (Laboras, n = 9 ratones para WT y 11 para KO, ANOVA de dos vías, Bonferroni post-hoc, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05, prueba t de Student para la distancia total movida). (B) Los ratones Dorfin-/- muestran una actividad locomotora normal en la prueba de campo abierto (entorno nuevo). Tenga en cuenta que el tiempo que pasa en la región central también es normal. (sem, n = 13 ratones para WT y 11 para KO, ns, no significativo, ANOVA de dos vías, post-hoc de Bonferroni, prueba t de Student). (C-E) Los ratones Dorfin-/- muestran niveles normales de comportamiento similar a la ansiedad en el laberinto en cruz elevado (C), el cuadro claro-oscuro (D) y las pruebas de alimentación con supresión de la novedad (E) (sem, n = 8 ratones para WT y KO en pruebas de laberinto en cruz elevado y caja de luz y oscuridad y 19 para ratones WT y KO en la prueba de alimentación suprimida por novedad, ns, no significativo, prueba t de Student). (F-I) Los ratones Dorfin-/- muestran niveles normales de aseo personal (F), convulsiones inducidas por PTZ (G), interacción social de tres cámaras (H) y coordinación motora rotarod (I) (sem, n = 8 ratones para WT y KO [autoaseo], 17 para WT y 14 para KO [convulsiones], 8 para WT y KO [tres cámaras] y 12 para WT y KO [rotarod], ns, no significativo, t de Student prueba).

A continuación, probamos si los ratones Dorfin-/- muestran comportamientos similares a la ansiedad mediante tres pruebas diferentes. Los ratones Dorfin-/- pasaron una cantidad de tiempo normal en la región central de la arena de campo abierto (Fig. 5B), en el brazo abierto/cerrado del laberinto en cruz elevado (Fig. 5C) y en la cámara de luz y oscuridad. de la caja claro-oscuro (Fig. 5D). En la prueba de alimentación suprimida por novedad, los ratones WT y Dorfin-/- mostraron niveles comparables de latencia para alimentarse en un nuevo campo abierto (Fig. 5E). Estos resultados indican que los ratones Dorfin-/- no muestran comportamientos similares a la ansiedad.

Por último, los ratones Dorfin-/- mostraron niveles normales de comportamiento de aseo personal (Fig. 5F), convulsiones inducidas por pentilentetrazol (PTZ) (Fig. 5G), interacción social y reconocimiento de novedad social en la prueba de tres cámaras (Fig. 5H ) y coordinación motora en la prueba rotarod (Fig. 5I). Estos resultados indican colectivamente que los ratones Dorfin-/- muestran un aumento específico en la actividad locomotora en un entorno familiar, pero no nuevo, mientras que otros comportamientos probados son normales.

Debido a que los ratones Dorfin-/- muestran una LTP mejorada en la región DG del hipocampo, sometimos a los ratones Dorfin-/- a una batería de pruebas conductuales de aprendizaje y memoria. En la prueba del laberinto acuático de Morris, que mide el aprendizaje espacial y la memoria43, los ratones Dorfin-/- se desempeñaron normalmente durante las fases de aprendizaje, sondeo e inversión (Fig. 6A). Los ratones Dorfin-/- también se desempeñaron normalmente en las pruebas de alteración recompensada del laberinto T y alteración espontánea del laberinto T, que miden la memoria de trabajo espacial44 (Fig. 6B, C). En la prueba de reconocimiento de objetos nuevos, que mide la memoria de reconocimiento de objetos y la preferencia de objetos nuevos, los ratones WT y Dorfin-/- mostraron una preferencia similar por el objeto nuevo (Fig. 6D).

Los ratones Dorfin-/- muestran un déficit específico en la memoria del miedo contextual, pero no en otros tipos de conductas de aprendizaje y memoria.

(A) Los ratones Dorfin-/- muestran un aprendizaje espacial y una memoria normales en las fases de aprendizaje, sondeo e inversión de la prueba del laberinto acuático de Morris (T: objetivo, L: izquierda, R: derecha, O: opuesto, sem, n = 14 ratones para WT y 16 para KO, ns, no significativo, ANOVA de dos vías, Bonferroni post-hoc, prueba t de Student). (B,C) Los ratones Dorfin-/- muestran una memoria de trabajo espacial normal en las pruebas de alteración T-maze recompensadas (B) y espontáneas (C) (8 ensayos durante 2 días constituyen un bloque; sem, recompensados, n = 7 para WT y 8 para KO; espontáneo, n = 9 para WT y 11 para KO, ns, no significativo, ANOVA de dos vías, post-hoc de Bonferroni, prueba t de Student). (D) Los ratones Dorfin-/- muestran una preferencia de objeto novedosa comparable a la de los ratones WT (sem, n = 8 para WT y 10 para KO, ns, no significativo, prueba t de Student). (E-G) Los ratones Dorfin-/- muestran una memoria de miedo contextual reducida, pero una extinción del miedo normal y un condicionamiento del miedo con claves. (sem, condicionamiento del miedo contextual, n = 16 para WT y KO; extinción del miedo contextual, n = 16 para WT y KO; condicionamiento del miedo con claves, n = 13 para WT y 15 para KO, ns, no significativo, ***p < 0,001, ANOVA de dos vías, post-hoc de Bonferroni, prueba t de Student). (H) Los ratones Dorfin-/- muestran neurogénesis suprimida en el DG adulto. Los cortes de hipocampo de ratones inyectados con BrdU (6 semanas) se marcaron tres veces para BrdU, doblecortina (DCX) y DAPI y se cuantificaron los números de células positivas para BrdU, así como células doblemente positivas para BrdU y DCX normalizadas a células positivas para DAPI. Barra de escala, 50 μm. (sem, n = 3 ratones para WT y n = 4 para KO, *p < 0,05, prueba t de Student). (I) Separación de patrón normal en ratones Dorfin-/-. (sem, n = 9 ratones para WT y n = 7 para KO, ns, no significativo, prueba t de Student, ANOVA de dos vías, post-hoc de Bonferroni).

En la prueba de condicionamiento de miedo contextual, los ratones Dorfin-/- mostraron una congelación reducida en la misma cámara de choque 24 horas después del condicionamiento en comparación con los ratones WT (Fig. 6E). Por el contrario, los ratones Dorfin-/- mostraron una extinción del miedo contextual y un condicionamiento del miedo con señales comparables a los de los ratones WT (Fig. 6F, G). Estos resultados sugieren colectivamente que los ratones Dorfin-/- tienen un déficit específico en el condicionamiento del miedo contextual, pero no en otros tipos de aprendizaje y memoria.

Los aumentos en la amplitud de mEPSC y LTP observados en la región DG de ratones Dorfin-/- podrían estar asociados con alteraciones en la neurogénesis adulta, conocida por regular la plasticidad sináptica en el DG45. Cuando las células en la región del borde interior de la capa de células granulares de DG se marcaron con BrdU, un marcador de células en división, el número de células positivas para BrdU se redujo significativamente en el adulto Dorfin-/- DG (6 semanas), en comparación con ese en ratones WT (Fig. 6H). Además, el número de células doblemente positivas para BrdU y doblecortina, un marcador de neuronas recién generadas, se redujo significativamente en Dorfin-/- DG. Estos resultados indican que la deleción de Dorfin conduce a la supresión de la neurogénesis en el DG adulto.

La neurogénesis en el DG adulto se ha asociado con la separación de patrones espaciales además del aprendizaje y la memoria espacial/contextual45,46,47. Por lo tanto, sometimos a los ratones Dorfin-/- a la prueba de discriminación contextual y descubrimos que los ratones Dorfin-/- normalmente podrían aprender a discriminar dos contextos similares, en los que uno está asociado con el shock del pie (Fig. 6I).

Si Dorfin actúa como una ubiquitina ligasa en el cerebro, deberíamos poder observar disminuciones en los niveles de ubiquitinación de las proteínas sustrato de Dorfin en el cerebro Dorfin-/-. Con este fin, inmunoprecipitamos lisados de hipocampo utilizando un anticuerpo que se dirige al péptido K-GG en proteínas ubiquitinadas, seguido de análisis de los precipitados por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) (Fig. 7A).

Identificación proteómica de proteínas con ubiquitinación reducida en el hipocampo Dorfin-/-.

(A) Procedimientos para la identificación de proteínas con ubiquitinación alterada en el cerebro Dorfin-/-. Los péptidos ubiquitinados de lisados de hipocampo se purificaron por inmunoafinidad con el anticuerpo K-GG, seguido de un análisis de espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para la secuenciación cualitativa, la identificación del sitio objetivo y la cuantificación. (n = 6 ratones para WT y 8 para KO en una muestra respectivamente). (B) Lista de proteínas cuyos niveles de ubiquitinación se reducen en >2,5 veces en el hipocampo Dorfin-/- en relación con los controles WT (consulte también la Tabla complementaria 1). Los círculos verdes indican las proteínas cuyos niveles de expresión se analizaron mediante inmunotransferencia de lisados de hipocampo (véase también la Fig. 7H). (C–G) Dorfin forma un complejo con cinco proteínas seleccionadas de la lista en la Fig. 7B. Las células HEK293 que expresan doblemente Myc-Dorfin y las proteínas indicadas se inmunoprecipitaron e inmunotransfirieron con anticuerpos Myc o EGFP. Rab11b (C), NFM (D), PPP1CA (E), PPP1CB (F) y H2AFZ (G). Entrada, 5%. (H) Niveles de expresión de proteínas en el hipocampo Dorfin-/- (2-3 meses) en relación con los de los controles WT, según lo determinado por el análisis de inmunotransferencia de lisados de hipocampo completos, la fracción de hipocampo sinaptosómica cruda (P2) y lisados de DG completos microdiseccionados . (sem, n = 3–6 para hipocampos WT y KO).

Clasificamos las proteínas positivas en orden de mayores disminuciones en la ubiquitinación, generando una lista de 24 proteínas cuyos niveles de ubiquitinación se redujeron sustancialmente (> 2,5 veces) en el cerebro Dorfin-/- en relación con los controles WT (Tabla complementaria S1). Estas proteínas podrían clasificarse en varios grupos funcionales, que incluyen moléculas de adhesión/matriz extracelular, adaptadores/armazones, proteínas relacionadas con la proteína G, fosfatasas, proteasas, enzimas y proteínas reguladoras del ciclo celular/cromatina (Fig. 7B).

Usando experimentos de coinmunoprecipitación en células heterólogas, verificamos la asociación de algunas de estas proteínas con Dorfin (Fig. 7C-G). Estas proteínas incluían Rab11b (una pequeña GTPasa), neurofilamento M, las subunidades α y β de la fosfatasa PP1 y la histona H2A. Inesperadamente, no se encontró que ninguna de estas cinco proteínas estuviera ubiquitinada cuando se coexpresaba con Dorfin en células heterólogas (Fig. 1 complementaria). Además, sus niveles de proteína no se alteraron en ratones Dorfin-/-, medidos mediante análisis de inmunotransferencia de lisados de hipocampo, la fracción sinaptosómica cruda del hipocampo y lisados de DG microdiseccionados (Fig. 7H). Además, no hubo cambios en los niveles de expresión de otras proteínas de la lista, incluidas ATP6V1A, Plexin A1/A4, NPEPPS, 14-3-3 η/ζ y gelsolina (Fig. 7H). Por lo tanto, la deleción de Dorfin in vivo no parece causar disminuciones detectables en los niveles de las proteínas analizadas.

Nuestro estudio indica que la eliminación de Dorfin en ratones conduce a una disminución de la neurogénesis en la DG, una mayor LTP en la vía MPP-DG y un déficit conductual específico en el condicionamiento del miedo contextual, pero no en otros tipos de aprendizaje y memoria. También identificamos a Dorfin como un nuevo socio de unión de PSD-95 e identificamos una serie de proteínas cuyos niveles de ubiquitinación disminuyen en ratones Dorfin-/-.

El significado funcional de la interacción entre Dorfin y PSD-95 no se exploró directamente en el presente estudio. Sin embargo, dado que PSD-95 es una proteína de andamiaje abundante enriquecida en las sinapsis excitatorias, es posible que PSD-95 promueva la orientación sináptica de Dorfin, como se demostró para muchas otras proteínas que interactúan con PSD-9548,49. Alternativamente, debido a que PSD-95 es una proteína multidominio que interactúa con diversas proteínas de membrana, de señalización y de andamiaje/adaptadoras49 y las ligasas E3 a menudo interactúan con proteínas adaptadoras/de andamiaje para ampliar el espectro de proteínas sustrato1,2,3,4,5, PSD-95 podría funcionar como una puerta de entrada a través de la cual Dorfin interactúa con diversos sustratos. Esto recuerda la interacción entre la proteína PDZ sináptica CASK/LIN-2 y Parkin50, una ligasa de ubiquitina E3 conocida por regular negativamente el número y la fuerza de la sinapsis excitatoria51 y proteger las neuronas postmitóticas de la excitotoxicidad52. Otro ejemplo es la interacción de Piccolo y Bassoon, dos grandes proteínas de zona activa que controlan el ensamblaje de proteínas presinápticas53, con Siah1 (una ligasa de ubiquitina E3), que se cree que promueve el mantenimiento de la integridad sináptica al modular la degradación de proteínas presinápticas30.

Los ratones Dorfin-/- mostraron dos fenotipos sinápticos en el hipocampo: aumento de la amplitud de mEPSC en las células granulares DG y aumento de la LTP inducida por HFS en las sinapsis MPP-DG. Estos resultados sugieren que Dorfin puede tener influencias negativas en los AMPAR sinápticos, así como en LTP. Desde el punto de vista del comportamiento, los ratones Dorfin-/- mostraron un deterioro específico en el condicionamiento del miedo contextual, pero no en otros tipos de aprendizaje y memoria, incluido el aprendizaje y la memoria espacial (laberinto de agua de Morris), la memoria de reconocimiento de objetos novedosos, la memoria de trabajo espacial (laberinto T), extinción del miedo, condicionamiento del miedo con claves y separación de patrones.

No está claro cómo la eliminación de Dorfin conduce a aumentos en la amplitud de mEPSC y LTP en el DG, aunque probablemente impliquen aumentos en el número o la función de AMPAR en condiciones basales o durante LTP. La fosforilación de dos sitios en la subunidad GluA1 de AMPAR, S831 y S845, se ha implicado en la regulación de las propiedades biofísicas de AMPAR y la plasticidad sináptica mediada por AMPAR54,55. Sin embargo, nuestros datos indicaron que los niveles de estas fosforilaciones no se alteraron en el cerebro Dorfin-/-, excluyendo esta posibilidad.

Nuestros datos brindan apoyo adicional a la idea de que las ligasas de ubiquitina E3 regulan la plasticidad sináptica, el aprendizaje y la memoria. Se ha demostrado que una deficiencia materna de Ube3A (ubiquitina proteína ligasa E3A) suprime la LTP y altera el condicionamiento del miedo contextual en ratones56. Además, la caída de Praja2 (dedo anular de praja 2, proteína ligasa de ubiquitina E3) en ratas suprime la LTP57 tardía. La LTP tardía y el condicionamiento del miedo contextual se suprimen en ratones Mindbomb-1-/-58 y ratones APC/C-Cdh1-/-59,60. Por último, se observa una LTP mejorada y un condicionamiento del miedo suprimido en ratones Scrapper-/- y Scrapper+/-, respectivamente61,62.

Nuestros resultados son únicos en el sentido de que una deleción de E3 en la región DG (no CA1) del hipocampo altera la LTP y el aprendizaje y la memoria. Esto está en línea con la asociación informada de las células granulares DG del hipocampo con el comportamiento espacial y el condicionamiento del miedo contextual63,64,65. Además, esto sugiere que las ligasas E3 en diversas regiones del cerebro además de la región CA1 del hipocampo son importantes para la regulación de la plasticidad sináptica, como se observó previamente en la amígdala de ratones APC/C-Cdh1-/-66, cuerpo estriado de Parkin-/ − ratones67 y corteza visual de ratones Ube3am−/p+68.

Un hallazgo notable fue que la LTP mejorada, no reducida, en ratones Dorfin-/- se asoció con un condicionamiento de miedo contextual deteriorado, en contra de nuestras expectativas. Sin embargo, estudios previos en ratones que carecen, por ejemplo, de las proteínas Fmr2, Gα1, PDE4D, IRSp53 y SCRAPPER, han relacionado la LTP hipocampal mejorada en la vía colateral de Schaffer con una disminución del condicionamiento del miedo contextual61,62,69,70,71,72,73. Estos resultados, junto con los nuestros, sugieren que la desviación de la LTP del hipocampo en cualquier dirección en la región DG o CA1 puede causar deficiencias similares en el aprendizaje y la memoria.

Aunque aún no se han determinado los mecanismos que conducen a una LTP mejorada y un condicionamiento de miedo contextual alterado en ratones Dorfin-/-, la lista de proteínas cuyos niveles de ubiquitinación se redujeron >2,5 veces en ratones Dorfin-/- podría proporcionar algunos puntos de partida. De hecho, muchas de estas proteínas están enriquecidas en la densidad postsináptica (PSD) y se han implicado en la regulación de la transmisión sináptica excitatoria, la plasticidad sináptica y el aprendizaje y la memoria (Tabla complementaria S1). Por ejemplo, Rab11a/b promueve la translocación de endosomas reciclados en espinas dendríticas y la exocitosis local de GluA1 durante LTP74,75,76,77. Por lo tanto, la ubiquitinación dependiente de Dorfin y la degradación de las proteínas Rab11a/b regularían negativamente la LTP. Además, los ratones transgénicos en los que los adaptadores de señalización 14-3-3η y 14-3-3ζ están funcionalmente inhibidos por la expresión genética de una proteína inhibidora muestran reducciones en el contenido sináptico de NMDAR, transmisión sináptica mediada por NMDAR, LTP y condicionamiento de miedo contextual78 , lo que sugiere que 14-3-3η y 14-3-3ζ regulan positivamente la plasticidad sináptica y el aprendizaje y la memoria. Por lo tanto, estas funciones pueden ser suprimidas por la degradación de la proteína 14-3-3 dependiente de Dorfin.

Contrariamente a nuestra expectativa inicial, nuestros datos indican que algunas de las proteínas que exhibieron disminución de la ubiquitinación en ratones Dorfin-/- se expresaron en niveles normales en el cerebro mutante, a pesar de nuestra demostración de que se asocian con Dorfin in vitro. Sin embargo, se ha demostrado que la ubiquitinación de proteínas tiene funciones distintas a la degradación de proteínas, como la modulación de la función de las proteínas, la endocitosis y la localización subcelular, así como las interacciones proteína-proteína1,2,3,4,5. Nuestros datos indican que al menos las cinco proteínas que demostramos que forman un complejo con Dorfin (Rab11b, neurofilamento-M, subunidad catalítica PP1-α, subunidad catalítica PP1-β e histona H2A.Z) no están directamente ubiquitinadas en células heterólogas. Dado que se encontró que estas proteínas estaban menos ubiquitinadas en el hipocampo Dorfin-/- a través de una pantalla imparcial, su ubiquitinación podría requerir ciertas condiciones únicas para los entornos neuronales/cerebrales, o algunas proteínas distintas de estas cinco proteínas pueden ser ubiquitinadas por Dorfin en heterólogos. células.

Por último, nuestros resultados indican que la neurogénesis en el DG adulto de Dorfin-/- está suprimida. Debido a que la neurogénesis adulta en el DG se ha implicado en la regulación de la plasticidad sináptica en las sinapsis del DG y los comportamientos dependientes del hipocampo, incluida la separación de patrones y el aprendizaje y la memoria espacial/contextual45,46,47,79, la neurogénesis reducida en el adulto Dorfin-/- DG podría estar asociado con el LTP mejorado y el condicionamiento del miedo contextual deteriorado en estos ratones. Sin embargo, debido a que se ha demostrado que la neurogénesis adulta reducida suprime tanto la LTP como la LTD80, nuestros resultados, donde la neurogénesis reducida se asoció con una LTP mejorada (pero no suprimida), difieren de los resultados anteriores. Sin embargo, la neurogénesis reducida en el DG adulto se ha asociado con un rendimiento reducido en el condicionamiento del miedo contextual en estudios previos45,81, lo que está en línea con nuestros resultados.

En conclusión, nuestro estudio identifica la ubiquitina ligasa E3 Dorfin como un nuevo ligando de PSD-95 y proporciona evidencia in vivo que respalda la hipótesis de que Dorfin puede regular la neurogénesis adulta, la transmisión sináptica excitatoria, la plasticidad sináptica y el condicionamiento del miedo contextual.

El ADNc de Dorfin de longitud completa se amplificó mediante PCR a partir de una biblioteca de ADNc de cerebro de rata y se subclonó en GW1 (British Biotechnology). Para Flag-Dorfin, Dorfin de rata en GW1 se amplificó por PCR y se subclonó en el vector p3XFLAG-CMV-7.1 (Sigma). Para Myc-Dorfin, Dorfin de rata de longitud completa se subclonó en pGW1-Myc. Se han descrito PSD-95, EGFP-PSD-93, EGFP-SAP97, EGFP-SAP102, EGFP-S-SCAM, Myc-GRIP2 de longitud completa para GST desplegable82. El pCFP-Rab11b completo fue un amable obsequio del Dr. Wondo Heo de KAIST. Se obtuvieron pEGFP-mNFM, pEGFP-PP1α, pEGFP-PP1β y pRK5-HA-Ub de longitud completa de Addgene (ID # 32909, 44224, 44223 y 17608 respectivamente). pEGFP-H2Afz se amplificó mediante PCR a partir de una biblioteca de ADNc de cerebro de ratón y se subclonó en pEGFP-N1.

Se han descrito los siguientes anticuerpos: EGFP83, PSD-93, SAP97, SAP102, S-SCAM84 y GluA185. Los siguientes anticuerpos se adquirieron de fuentes comerciales: monoclonal de ratón PSD-95 K28/43, GluN2B N59/36 (UC Davis/NIH NeuroMab Facility) NR1/GluN1 (BD Pharmingen), GluN2A, NPEPPS, NeuN (Millipore), pGluR1 S831 y S845 (señalización celular), GluA2, policlonal de conejo y monoclonal de ratón Myc, ATP6V1A, Rab11, 14-3-3η, 14-3-3ζ, PP1, ubiquitina (Santa Cruz Biotechnology), HA monoclonal de ratón (Roche Molecular Biochemicals), ratón Flag M2 monoclonal (Sigma), α-tubulina (Sigma), GABARα1 (SySy), doblecortina, plexina A1 y A4, gelsolina (Abcam), BrdU (Novus Biologicals). Los ensayos de inmunotransferencia se realizaron utilizando Odyssey Fc (LI-COR Biosciences).

Los últimos 7 aminoácidos de Dorfin de ratón (aa 834–840, WT e I840A) se generaron recociendo oligonucleótidos y subclonándolos en pBHA. Los dominios PDZ de varias proteínas se subclonaron en pGAD10 (un vector presa: Clontech) como se describió anteriormente86. Los ensayos de dos híbridos de levadura se realizaron como se describió anteriormente87.

Para la extracción, los últimos siete aminoácidos de Dorfin de ratón (aa 834–840, WT e I840A) se generaron recociendo oligonucleótidos y subclonándolos en pGEX-4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech). Para la extracción, las células HEK293T se transfectaron con PSD-95, EGFP-SAP97, EGFP-PSD-93, EGFP-SAP102, EGFP-S-SCAM, Myc-GRIP2. Los precipitados extraídos se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos PSD-95, EGFP y Myc.

La hibridación in situ se realizó como se describió previamente82. Las sondas de hibridación para el ARNm de Dorfin de ratón se prepararon usando nt 2161–2820 de Dorfin de ratón (NM_013923.2) y se subclonaron en el vector pGEM-7Zf. Las sondas de hibridación para ARNm de Dorfin de rata se prepararon usando nt 2609–3187 de Dorfin de rata (NM_001130560.1) y se subclonaron en el vector pGEM-7Zf.

Myc-Dorfin y HA-ubiquitina se transfectaron triple o doblemente (sin Dorfin) con EGFP-Rab11b, EGFP-NFM, EGFP-PPP1CA, PPP1CB-EGFP o H2Afz-EGFP en células HEK293. Los lisados celulares (SDS al 2 %, NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM) diluidos en un tampón de dilución (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, Triton X-100 al 1 %) se incubaron con anticuerpos EGFP, seguido de análisis de inmunoprecipitación e inmunotransferencia.

Los ratones Dorfin-/- se generaron a partir de esperma de ratón con el casete de captura de genes insertado en el intrón entre el exón 2 y el exón 3 del gen Dorfin, obtenido de TIGM (OST244733). Los ratones con antecedentes genéticos de 129/SvEv se retrocruzaron con ratones C57BL6 durante más de cinco generaciones. Los ratones para los experimentos se obtuvieron apareando ratones heterocigotos macho y hembra. Los ratones se mantuvieron de acuerdo con los requisitos de investigación animal en KAIST y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de investigación animal en KAIST (KA2012-19). Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes. Los ratones se alojaron en un ambiente de jaula estándar bajo ciclos de luz y oscuridad de 12 horas.

Los cebadores para la PCR de genotipado fueron 5′-CGG-GCT-GGG-TTT-ACA-TAG-AA-3′ (WT 5′), 5′-GAC-CCA-AAT-GTC-CAT-CAA-CC-3′ ( WT 3′) y 5′-CAA-AAT-GGC-GTT-ACT-TAA-GC-3′ (Trampa 5′). Los cebadores para RT-PCR constaban de 4 conjuntos. Dorfin 1: 5′-ACT-GAA-CGG-TTT-AAT-CCT-C-3′ y 5′-CTG-TTC-CAC-AGC-CTT-CTC-3′. Dorfin 2: 5′-TGT-TTC-AAC-AGG-TTG-GAA-GTA-3′ y 5′-GCG-TTA-TCA-CTA-ACT-GTT-CCC-AAG-3′. Dorfin 3: 5′-ATC-AAG-GGA-GCT-CAA-TGG-TGG-3′ y 5′-GCA-TCA-CAG-GTC-TGG-TTT-GG-3′Dorfin 4: 5′-GCA- AGA-TGG-TGG-CAG-TTT-TT-3′ y 5′-CTA-ATG-GGA-CCG-TCT-TCT-GC-3′. Los cebadores para qPCR fueron 5′-ACT-GAA-CGG-TTT-AAT-CCT-C-3′ y 5′-CTG-TTC-CAC-AGC-CTT-CTC-3′.

Se prepararon cortes de cerebro de ratones a las 4 y 8 semanas. Las secciones de cerebro (50 μm) se permeabilizaron con TritonX-100 al 0,5 % durante 30 min y se tiñeron con el anticuerpo NeuN. Después de 24 horas, las secciones se tiñeron con anticuerpos secundarios durante 2 horas, seguido de la adquisición de imágenes con un microscopio confocal (LSM780, Carl Zeiss).

Se inyectó 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU, Sigma) por vía intraperitoneal (50 mg/kg) a ratones (6 semanas) durante 3 días. Cinco días después de la última inyección, los ratones se perfundieron con paraformaldehído al 4%. Los cortes de cerebro fijos (50 μm) obtenidos por vibratomo se incubaron en HCl 1 N durante 10 min en hielo, seguido de HCl 2 N durante 10 min a temperatura ambiente antes de moverlos a una incubadora a 37 °C durante 20 min. Se añadió tampón de borato (0,1 M) a los cortes durante 12 min a temperatura ambiente. A continuación, los cortes se incubaron con anticuerpos BrdU y DCX a 4 °C durante 12 horas, seguido de una tinción con anticuerpos secundarios y montaje con Vectashield y DAPI. Las imágenes de corte se adquirieron mediante microscopía confocal (LSM780, Zeiss).

Las neuronas piramidales en la región CA1 y las células granulares en la región DG del hipocampo se eligieron al azar y se infundieron con biocitina (0,5%) durante 5 min. Después de la inyección, los cortes se recogieron y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 24 horas. Los cortes se tiñeron con anticuerpo de estreptavidina. Las imágenes se capturaron utilizando objetivos de 20x (LSM 780, Carl Zeiss). Las intersecciones de las ramas dendríticas se analizaron manualmente de forma ciega.

La fracción sinaptosómica cruda (P2) del hipocampo de ratón adulto (2–3 meses) se preparó como se describió anteriormente88. Se prepararon lisados de hipocampo/DG completos utilizando tampón de homogeneización (sacarosa 0,32 M, HEPES 10 mM, EDTA 2 mM). Para la microdisección de DG, usamos vibratome para cortar rodajas de cerebro (400 μm) y diseccionar DG.

Los tejidos del hipocampo se congelaron en nitrógeno líquido, seguido del análisis Ubiscan (señalización celular) usando inmunoprecipitación con péptido K-GG y LC-MS/MS (LTQ-Orbitrap-Velos y ESI-CID). Los espectros MS/MS se analizaron utilizando SEQUEST 3G y la plataforma SORCERER 2 de Sage-N Research (v 4.0, Milpitas CA).

Se prepararon cortes sagitales de hipocampo (300 μm para registros de células enteras, 400 μm para registros de campo) utilizando un vibratomo (VT1200S, Leica) en tampón de corte helado (sacarosa 212 mM, NaHCO3 25 mM, KCl 5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, D-glucosa 10 mM, piruvato de sodio 2 mM, ascorbato de sodio 1,2 mM, MgCl2 3,5 mM y CaCl2 0,5 mM burbujeados con O2 al 95 %/CO2 al 5 %) y recuperados a 32 °C en LCR (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, KCl 2,5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, D-glucosa 10 mM, MgCl2 1,3 mM y CaCl2 2,5 mM). Después de 30 min, los cortes se mantuvieron a temperatura ambiente. Las grabaciones de pinzamiento de parche de células enteras y las grabaciones de potencial de campo se realizaron como se describió anteriormente72. Las grabaciones se realizaron utilizando un amplificador Multiclamp 700B y Axopatch 200B. Los datos se analizaron utilizando Clampfit 10.2 (Molecular Devices).

Los registros de células completas para mEPSC y la relación NMDA/AMPA se realizaron con pipetas de registro (3–5 MΩ) llenas de solución interna (117 mM CsMeSO4, 10 mM TEA-Cl, 8 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM QX-314 -Cl, Mg-ATP 4 mM, Na-GTP 0,3 mM y EGTA 10 mM). Para las mediciones de mIPSC, las pipetas se llenaron con una solución que contenía CsCl 115 mM, TEA-Cl 10 mM, NaCl 8 mM, HEPES 10 mM, QX-314-Cl 5 mM, Mg-ATP 4 mM, Na-GTP 0,3 mM, EGTA 10 mM. Todas las soluciones internas se ajustaron para adquirir pH 7,3 y 290–300 mOsm. Las señales se filtraron a 1,0 kHz para mEPSC y mIPSC y a 2,0 kHz para experimentos de relación NMDA/AMPA. Para mEPSC, se agregaron picrotoxina (50 μM) y TTX (0, 5 μM) a aCSF. Para el registro de mIPSC, se agregaron picrotoxina (50 μM), NBQX (10 μM) y AP5 (25 μM). Para los experimentos de relación NMDA/AMPA, se añadió picrotoxina (100 μM). Las grabaciones de mEPSC y mIPSC se realizaron a un potencial de mantenimiento de −70 mV durante 2 min. Para los experimentos de relación NMDA/AMPA, se evocaron los EPSC con una pipeta de vidrio que contenía aCSF posicionada en la ruta MPP-DG. Los EPSC de AMPA se registraron a −70 mV. Después de obtener de 25 a 30 trazas estables, el potencial de retención se cambió a +40 mV para registrar los EPSC de NMDA (20 trazas). Se usaron NMDA EPSC a los 50 ms después de la estimulación para la relación NMDA/AMPA.

Los registros de potencial de campo se realizaron con pipetas de registro llenas de aCSF. Para registros de relación de pulsos emparejados y de entrada/salida, se registraron fEPEP estables durante 10 minutos antes de que comenzaran los experimentos principales. Para las grabaciones de entrada/salida, los estímulos se aumentaron gradualmente para inducir amplitudes de descarga de fibra de 0,05 a 0,3 mV/ms y se registraron 3 trazas por estímulo. Para registros de relación de pulso emparejados, los intervalos entre estímulos fueron de 25, 50, 100, 200 y 300 ms. Las grabaciones se repitieron 3 veces. Para la estimulación de alta frecuencia LTP, se agregó picrotoxina (100 μM) a aCSF. Después de obtener respuestas basales estables durante 20 min, se administró un único estímulo de 100 Hz (1 s) a la vía SC-CA1 y cuatro series de estímulos de 100 Hz (cada 1 s; 20 s de intervalo entre series) a la vía MPP-DG. Las respuestas se registraron durante una hora.

Para el seguimiento continuo a largo plazo de los movimientos del ratón, utilizamos el sistema LABORASTM (Metris), diseñado para detectar vibraciones originadas por los movimientos de un ratón en la jaula. Los ratones se aislaron individualmente y se habituaron en jaulas LABORAS en la sala de grabación durante 3 días. Después de la habituación, la jaula de LABORAS con un ratón se colocó encima de una plataforma de grabación sensible a vibraciones durante 72 horas. Los datos de las últimas 48 horas se analizaron y promediaron en ciclos de 24 horas.

Los ratones se colocaron en una caja de 40 × 40 × 40 cm y se registró su actividad locomotora horizontal en completa oscuridad (~0 lux) durante una hora. La línea de la zona central estaba separada 10 cm del borde. Los movimientos se analizaron utilizando Ethovision XT 10 (Noldus).

El laberinto, elevado a una altura de 50 cm desde el suelo, constaba de dos brazos abiertos, dos brazos cerrados y una zona central. Se registraron los movimientos de los ratones colocados en la zona central durante 7 min y se analizó manualmente el tiempo que pasaban con los brazos cerrados o abiertos.

La caja tenía unas dimensiones de 12 × 30 × 20 cm para la cámara de luz (~250~300 lux) y 14 × 13 × 20 cm para la cámara oscura (~0~5 lux). Se colocó un ratón en el centro de la cámara de luz, seguido de un seguimiento del movimiento durante 10 min. El tiempo pasado en la cámara de luz u oscuridad se analizó manualmente.

Los ratones se privaron de alimento durante 24 horas y se colocaron en una nueva caja de 40 × 40 × 40 cm. Se colocó una bolita de comida en el centro de la caja y se midió la latencia para acercarse y comer la comida.

Los ratones se colocaron en una jaula doméstica vacía y se registró su comportamiento de aseo personal durante 10 min. El comportamiento de aseo personal se definió como acariciar o rascarse la cara, la cabeza o áreas del cuerpo con las extremidades anteriores, o lamer partes del cuerpo. El tiempo de aseo personal se midió de forma ciega.

A los ratones se les inyectaron 50 μg/peso (g) de pentilentetrazol (PTZ) en la cavidad intraperitoneal y se registraron las convulsiones durante 10 min. Las convulsiones se definieron como movimientos convulsivos que incluyen convulsiones clónicas y/o tónico-clonínicas mientras se está acostado de lado y/o saltos salvajes.

Esta prueba se realizó para medir la interacción social y el reconocimiento de la novedad social89. El aparato constaba de 3 cámaras con una dimensión de 12 × 20 × 26 cm para la cámara central y 14 × 20 × 26 cm para las cámaras laterales. Ambas cámaras laterales tenían jaulas de plástico en las esquinas para colocar objetos o ratones. El experimento consistió en 4 sesiones, incluida la habituación en la cámara central (10 min), habituación en todas las cámaras (10 min), exploración de objeto/ratón (10 min) y exploración de ratón antiguo/novedoso (10 min). En la tercera sesión, un ratón extraño WT se confinó suavemente en una jaula de plástico y se colocó un objeto inanimado en la jaula de plástico opuesta. Se permitió que los ratones se movieran y exploraran libremente y se midieron los tiempos de olfateo y cámara para el análisis de la interacción social. El olfateo se definió como la nariz del ratón mirando hacia y acercándose al objeto objetivo o al ratón. En la última sesión, el objeto fue reemplazado por un nuevo ratón extraño WT. Las posiciones del objeto y el extraño 1 se alternaron de manera aleatoria para evitar la preferencia de lado.

Los ratones se colocaron suavemente sobre la varilla giratoria del aparato rotarod (Stoelting), seguido de un aumento en la velocidad de la varilla de 4 a 40 rpm durante 5 min. Los experimentos se realizaron durante 5 días consecutivos, midiendo la latencia a la caída de la varilla.

Se entrenó a ratones en un tanque circular (100 cm de diámetro) lleno de agua blanca opaca (22–24 °C) para encontrar una plataforma oculta (10 cm de diámetro). La fase de aprendizaje consistió en 3 ensayos por día durante 5 días. Para la prueba de la sonda (1 min), se retiró la plataforma y se midió el tiempo que un ratón pasó explorando cada cuadrante. En la prueba de inversión (3 días), la plataforma se reubicó en la posición del cuadrante opuesto. Los movimientos del ratón se analizaron con EthoVision XT 10 (Noldus)

Esta prueba se realizó como se describió previamente44. En resumen, los ratones desnutridos con un peso corporal del 80 al 85 % de un rango normal se habituaron a la arena del laberinto en T durante 5 min durante 2 días, seguido de un entrenamiento con 20 μl de recompensa de leche al 70 % durante 10 días.

A los ratones colocados en el punto de inicio se les permitió explorar libremente los dos brazos del laberinto. Cuando un ratón entra en uno de los dos brazos, vuelve al punto de inicio después de pasar 5 segundos en el brazo para la siguiente ronda, que se repite 10 veces.

A los ratones, habituados a una caja de campo abierto durante 60 minutos el día 1, se les presentaron dos objetos idénticos durante 11 minutos el día 2. El día 3, uno de los objetos se reemplazó por uno nuevo. El reconocimiento de objetos se midió por la cantidad de tiempo durante el cual la nariz del ratón apuntó al objeto.

El día 1, los ratones se habituaron a la cámara de choque (Coulbourn Instruments) durante 5 min. El día 2, un ratón pasó 3 minutos en la cámara antes de recibir descargas en las patas (0,8 mA) en puntos de tiempo de 3, 4 y 5 minutos y se cuantificaron los niveles de congelación durante 3 a 6 minutos. En el día 3, los ratones se volvieron a exponer a la cámara sin shock en las patas durante 5 min y se cuantificaron los niveles de congelación durante estos 5 min. El comportamiento de congelación se analizó utilizando el software FreezeFrame 3 (Coulbourn Instruments). Para la extinción del miedo contextual, los ratones se expusieron a la misma cámara de choque durante 5 min durante 10 días consecutivos.

Los ratones sin habituación pasaron 3 minutos en la cámara de choque del contexto A antes de recibir una señal auditiva (4 kHz, 75 dB) durante 30 segundos que terminó con un choque de pie de 2 segundos (0,8 mA). Este condicionamiento se repitió 3 veces con intervalos de un minuto. Veinticuatro horas más tarde, se colocó un ratón en el contexto B, donde pasó 3 minutos antes de recibir la misma señal auditiva durante 3 minutos. Se analizó el comportamiento de congelación durante este período de 3 min.

Sometimos a los ratones a una prueba de condicionamiento del miedo contextual utilizando un par de contextos menos distintos (A y B) que compartían un piso de rejilla de metal idéntico, pero tenían papel de pared, color de fondo e iluminación únicos. En este protocolo, el condicionamiento del miedo se llevó a cabo gradualmente durante varios días para investigar los efectos de las experiencias repetidas. Los experimentos se realizaron en las mismas condiciones de tiempo, temperatura y humedad: 2 a 9 pm, 20 a 22 °C y 45 %. Cada prueba se realizó después de la habituación en su jaula durante 30 a 60 minutos y dos veces al día. Durante los días 1 a 3 del experimento, los ratones se colocaron en una cámara de choque durante 180 s, se les dio una sola descarga de 0,8 mA en las patas durante 2 s y se sacaron después de 60 s. En los días 4 y 5, para generalizar, los ratones de cada genotipo se dividieron en dos grupos, uno visitando la cámara A y el otro visitando la cámara B (una prueba/día) durante 4 min el día 4 y visitando las cámaras no visitadas el día 5. Los ratones no recibieron descargas en las patas durante la generalización y se evaluó la congelación. Durante los días 6 a 13, para el entrenamiento de discriminación, los ratones visitaron las dos cámaras todos los días durante 8 días y siempre recibieron una descarga eléctrica en las patas (0,8 mA durante 2 s) a los 180 s después de colocarlos en la cámara A pero no en la cámara B, seguidos 1 más estancia mínima. Se utilizó la congelación durante los primeros 3 minutos de exposición en cada cámara para calcular la tasa de discriminación diaria.

Todos los resultados conductuales se analizaron de forma ciega.

Cómo citar este artículo: Park, H. et al. Los ratones que carecen de la ligasa E3 que interactúa con PSD-95, Dorfin/Rnf19a, muestran una neurogénesis adulta reducida, una potenciación mejorada a largo plazo y un condicionamiento del miedo contextual deteriorado. ciencia Rep. 5, 16410; doi: 10.1038/srep16410 (2015).

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación del Cerebro a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura (2014047939 a HK) y el Instituto de Ciencias Básicas (IBS) (IBS-R002-D1 a EK).

Escuela de Graduados en Ciencias Médicas e Ingeniería, Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea (KAIST), Daejeon, 305-701, Corea

parque hanwool

Departamento de Ciencias Biológicas, KAIST, Daejeon, 305-701, Corea

Jinhee Yang, Ryunhee Kim, Chungwoo Lee, Jongil Park y Eunjoon Kim

Centro de Disfunciones Cerebrales Sinápticas, Instituto de Ciencias Básicas (IBS), Daejeon, 305-701, Corea

Yan Li, Yeunkum Lee y Eun Joon Kim

Departamento de Anatomía y División del Cerebro Corea 21. Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Corea, Seúl, 136-704, Corea

Dongmin Lee y Hyun Kim

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JY realizó Y2H, pull down y una parte de los experimentos de coinmunoprecipitación; RK realizó una parte de experimentos electrofisiológicos y experimentos de neurogénesis adulta; YL realizó experimentos de neurogénesis en adultos; YL realizó ensayos de ubiquitinación in vitro; JP y CL realizaron una parte de los experimentos de comportamiento; DL realizó experimentos de hibridación in situ; HP realizó todos los demás experimentos; EK y HK escribieron el manuscrito.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Park, H., Yang, J., Kim, R. et al. Los ratones que carecen de la ligasa E3 que interactúa con PSD-95, Dorfin/Rnf19a, muestran una neurogénesis adulta reducida, una potenciación a largo plazo mejorada y un condicionamiento del miedo contextual deteriorado. Informe científico 5, 16410 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16410

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Recibido: 01 Junio 2015

Aceptado: 14 de octubre de 2015

Publicado: 10 noviembre 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16410

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