Subsistemas de dopamina que rastrean estados internos

Nature, volumen 608, páginas 374–380 (2022)Citar este artículo

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La comida y el agua son gratificantes en parte porque satisfacen nuestras necesidades internas1,2. Las neuronas dopaminérgicas en el área tegmental ventral (VTA) se activan mediante recompensas gustativas3,4,5, pero se desconoce cómo los animales aprenden a asociar estas señales orales con los efectos fisiológicos retardados de la ingestión. Aquí mostramos que las neuronas dopaminérgicas individuales en el VTA responden a la detección de nutrientes o agua en etapas específicas de ingestión. Un subconjunto importante de neuronas dopaminérgicas rastrea los cambios en la hidratación sistémica que ocurren decenas de minutos después de que los ratones sedientos beben agua, mientras que diferentes neuronas dopaminérgicas responden a los nutrientes en el tracto gastrointestinal. Mostramos que la información sobre el equilibrio de líquidos se transmite al VTA a través de una vía hipotalámica y luego se redirige a los circuitos posteriores que rastrean las etapas de ingestión oral, gastrointestinal y posterior a la absorción. Para investigar la función de estas señales, utilizamos un paradigma en el que los efectos orales y posteriores a la absorción de un fluido pueden manipularse de forma independiente y separarse temporalmente. Mostramos que los ratones aprenden rápidamente a preferir un líquido sobre otro basado únicamente en su capacidad de rehidratación y que este aprendizaje posterior a la ingestión se evita si las neuronas dopaminérgicas en el VTA se silencian selectivamente después del consumo. Estos hallazgos revelan que el sistema de dopamina del cerebro medio contiene subsistemas que rastrean diferentes modalidades y etapas de ingestión, en escalas de tiempo de segundos a decenas de minutos, y que esta información se utiliza para impulsar el aprendizaje sobre las consecuencias de la ingestión.

Los animales deben decidir qué comer y beber. Esto presenta un desafío porque el valor nutricional de una fuente de alimento puede no ser evidente a partir de su apariencia externa y las consecuencias de su ingestión no son evidentes al instante. Más bien, los animales deben aprender a través de la experiencia de ingestión los valores de alimentos y líquidos específicos, si vale la pena esforzarse por obtenerlos y si deben consumirse si se encuentran6,7,8. Por ejemplo, muchos animales obtienen la mayor parte de su agua de los alimentos9,10,11,12,13,14,15 y, por lo tanto, es probable que aprendan a través de la retroalimentación posterior a la ingesta qué fuentes de alimentos se están rehidratando.

Muchos aspectos del aprendizaje sobre las recompensas involucran neuronas dopaminérgicas (DA) en el área tegmental ventral VTA16,17,18,19,20,21 (neuronas VTA-DA). En respuesta al sabor de la comida3,4 o el agua4,5, las neuronas VTA-DA liberan una ráfaga de dopamina que confiere valor a las señales asociadas. Sin embargo, el sabor de la comida y el agua son en sí mismos señales que predicen la subsiguiente satisfacción de una necesidad interna (como la rehidratación), y su valor puede cambiar a medida que los animales aprenden sobre los efectos posteriores a la ingestión de alimentos y líquidos específicos1,8,22. Esto plantea la cuestión de cómo los nutrientes y fluidos internos, que son los refuerzos finales del comportamiento, están representados en el sistema de dopamina y se utilizan para impulsar el aprendizaje.

Para investigar cómo responden las neuronas DA a los cambios internos en el equilibrio de líquidos, registramos su actividad antes y después del consumo de agua. Los ratones se equiparon para obtener imágenes microendoscópicas de la dinámica del calcio en las neuronas VTA-DA (definidas por la expresión de DAT-cre; Fig. 1a), se les privó de agua durante la noche y luego se les dio acceso sin restricciones al agua durante 5 min. Los ratones bebieron vorazmente (Datos extendidos Fig. 1j) y, como se esperaba, muchas neuronas DA se activaron transitoriamente de una manera bloqueada en el tiempo para lamer4,5 (22%; Datos extendidos Fig. 1b y Tablas de datos extendidos 1 y 2). Sin embargo, también detectamos una segunda ola inesperada de activación de la neurona DA que surgió después de un retraso de 10.1 ± 0.6 min desde el comienzo de la bebida (Fig. 1b-e y Datos extendidos Fig. 1c-i). Esta activación retardada reclutó muchas neuronas DA (39 %), implicó aumentos tanto en la fluorescencia inicial como en los estallidos fásicos, y no estuvo relacionada con lamer (la botella de agua había desaparecido). En cambio, reflejó el curso de tiempo informado para la absorción de agua en la sangre23,24,25,26, lo que sugiere que la rehidratación sistémica en sí desencadena la activación retardada de muchas neuronas DA.

a, Imagen representativa de la colocación de lentes GRIN y neuronas VTA-DA que expresan GCaMP6. b, Mapas de ajuste de las respuestas de las neuronas DA desde el mismo campo de visión durante y después de beber agua. c, Trazas de ejemplo de la dinámica del calcio en cinco neuronas representativas durante y después del consumo de agua. d, Respuestas neuronales individuales al consumo de agua, infusión intragástrica (IG) de agua (1,2 ml) e inyección intraperitoneal (IP) de agua (1,2 ml) o solución salina hipertónica (3 M NaCl, 0,12 ml). e, Puntuación z ponderada por población (calculada como la fracción de neuronas activadas o inhibidas multiplicada por su cambio de actividad con puntuación z) para cada uno de los estímulos mostrados. Los porcentajes de neuronas activadas (rojo) e inhibidas (azul) se enumeran encima y debajo de cada gráfico de barras. 'Post-ingestión' es de 0 a 20 min después del final del consumo de agua o NaCl 0,3 M a su propio ritmo; 'después de la infusión IG' es de 0 a 20 min después del final de la infusión intragástrica (1,2 ml) de agua o NaCl 0,3 M; 'después de la inyección IP' es de 0 a 30 min después de la inyección intraperitoneal de agua (1,2 ml), NaCl (3 M, 0,12 ml), isoproterenol (100 mg kg−1) o polietilenglicol (PEG) (40%, 0,4 ml ). f, Arriba, curso temporal de la activación y luego regreso a la línea de base de las neuronas VTA-DA individuales después de la infusión intragástrica de agua (1,2 ml). Abajo, trazo medio. Los ratones son de una cohorte separada de los utilizados en d. g, trazas de actividad media de las neuronas (de d) activadas por inyección de agua intraperitoneal (rojo) e inhibidas por inyección de NaCl intraperitoneal (azul), con cambios de osmolalidad sanguínea concurrentes representados a continuación. NS, P > 0,05; **P < 0,01, ***P < 0,001. Los datos son la media ± sem. Las estadísticas se presentan en la Tabla 2 de datos ampliados.

Para probar si esta respuesta tardía requiere rehidratación, les dimos a los ratones acceso a una solución hipertónica (NaCl 300 mM) que beberán los ratones ingenuos, pero que finalmente los deshidrata27. El consumo de este líquido provocó la activación transitoria de las neuronas DA durante la bebida (Datos ampliados, Fig. 1b, k), pero no resultó en un aumento retardado de la actividad de la dopamina (Fig. 1e), a pesar de niveles similares de consumo total (Datos ampliados, Fig. 1j) . Es de destacar que también se inhibió una pequeña población de neuronas, pero la magnitud de esta inhibición fue la misma después del consumo de agua o solución salina hipertónica (Fig. 1e).

Para probar si la rehidratación es suficiente para la activación de la neurona DA, equipamos a los ratones con catéteres intragástricos para la infusión directa de fluidos en el estómago28. La infusión de agua29 (1,2 ml durante 12 min) dio como resultado una activación retardada de muchas neuronas registradas (Fig. 1d, e, Datos extendidos Fig. 1m,n y Datos extendidos Fig. 2). Esto ocurrió 14 ± 1 min después del inicio de la infusión (variando ligeramente con la velocidad de la infusión; datos extendidos Fig. 1o) y persistió durante 30 ± 0,7 min antes de regresar gradualmente a la línea base (Fig. 1f). El porcentaje de neuronas activadas y la magnitud de su activación fueron similares después de beber a su propio ritmo e infusión intragástrica (Fig. 1e). En particular, esta activación no estuvo acompañada de grandes cambios en el movimiento (Datos extendidos Fig. 1p), se observó una respuesta más pequeña si los ratones no estaban privados de agua de antemano (Datos extendidos Fig. 1q) y se observó una inhibición neta si hipertónica ( En su lugar, se infundió solución salina NaCl 300 mM (Fig. 1e), lo que indica que la rehidratación es necesaria y suficiente para la respuesta de la neurona DA.

La rehidratación puede causar cambios en la osmolalidad, el volumen y la presión de la sangre, todo lo cual influye en la sed. Por lo tanto, manipulamos de forma independiente estas señales para determinar cuáles son responsables de la activación de las neuronas DA después de la ingestión de agua. Las inyecciones intraperitoneales de agua y solución salina hipertónica dieron como resultado la activación e inhibición, respectivamente, de muchas neuronas DA (Fig. 1d, e), y el curso temporal de estas respuestas neuronales DA siguió los cambios concurrentes en la osmolalidad de la sangre (Fig. 1g). La inyección de manitol inhibió las neuronas DA de manera similar a la solución salina hipertónica equiosmótica (lo que indica que la respuesta refleja cambios en la osmolalidad y no cambios en la concentración de sodio; datos extendidos Fig. 1r), y la respuesta de la neurona DA ocurrió en segundos cuando la sal se administró por vía intravenosa (lo que indica que refleja un cambio sistémico (datos extendidos Fig. 1s–t). Por el contrario, las inyecciones de polietilenglicol o isoproterenol, que disminuyen el volumen sanguíneo y la presión arterial, respectivamente27,30,31, provocaron respuestas neuronales DA mucho más pequeñas (Fig. 1e). Por lo tanto, muchas neuronas VTA-DA rastrean de manera específica y bidireccional los cambios en la osmolalidad sistémica, lo que revela un papel inesperado para el equilibrio de líquidos en el control de la actividad del sistema de dopamina.

Luego comparamos cómo las neuronas DA responden al agua y los nutrientes. Primero confirmamos que el consumo de la dieta líquida Asegúrese por parte de ratones hambrientos resultó en la activación transitoria de muchas neuronas DA bloqueadas en el tiempo para lamer3,4 (Datos extendidos Fig. 3a,b). Para aislar claramente las señales posteriores a la ingestión, registramos las respuestas de dopamina a la infusión de Guarantee directamente en el estómago (en una cantidad (1,2 kcal) que se aproxima a una comida de tamaño moderado32 e inhibe las neuronas AgRP que promueven el hambre33). Esto reveló que distintos subconjuntos de neuronas DA se activan durante la infusión de nutrientes (10 % de las neuronas DA, cuando los nutrientes ingresan al tracto gastrointestinal) y después (13 % de las neuronas DA; cuando la mayoría de los nutrientes se absorben en la sangre; Datos extendidos Fig. 3c– mi). Esto indica que, en relación con el agua, los nutrientes activan más neuronas DA mientras están en el tracto gastrointestinal, pero menos después de la absorción en el torrente sanguíneo (Datos extendidos Figs. 1u y 3c, d).

A continuación, comparamos cómo las neuronas DA individuales responden a estos diferentes estímulos al alinear sus respuestas en los experimentos (Fig. 2a). Para beber, las neuronas individuales respondieron consistentemente a los cambios en el equilibrio de líquidos, independientemente del método de administración de líquidos. Por ejemplo, la mayoría de las neuronas activadas después de la inyección intraperitoneal de agua o de beber a su propio ritmo también se activaron después de la infusión intragástrica de agua (Fig. 2e y Datos extendidos Fig. 4e). Las neuronas activadas después de la inyección intraperitoneal de agua se inhibieron correspondientemente mediante la inyección de solución salina hipertónica (Fig. 2f). De manera similar, para los nutrientes, la respuesta de las neuronas individuales después de la infusión intragástrica de Ensure se correlacionó con su respuesta después de la inyección o infusión de glucosa (Datos extendidos Fig. 4f,h). En contraste con estas respuestas consistentes a los cambios sistémicos, no hubo correlación en las respuestas neuronales individuales a través de las etapas de ingestión (por ejemplo, durante versus después de lamer; datos extendidos Fig. 4a-d) o entre agua y nutrientes en la misma etapa (Fig. .2b–d). Esto revela que hay subconjuntos de neuronas VTA-DA que están sintonizadas para rastrear nutrientes o líquidos en una etapa específica de la ingestión.

a, Mapas de neuronas VTA-DA individuales rastreadas a lo largo de días experimentales durante la obtención de imágenes. b, Trazas de ejemplo de neuronas que respondieron específicamente a la infusión intragástrica (1,2 ml) de Guarantee o agua. c, Izquierda, proporción de neuronas activadas durante la infusión intragástrica de Ensure y agua. A la derecha, las neuronas individuales no muestran correlación en su respuesta durante la infusión intragástrica de agua frente a Guarantee. d, Izquierda, proporción de neuronas activadas de 0 a 20 minutos después del final de la infusión intragástrica de agua o de Guarantee. A la derecha, las neuronas individuales no muestran correlación en su respuesta después de la infusión intragástrica de agua frente a Ensure. e, Izquierda, trazos de ejemplo que muestran las neuronas activadas después de la infusión intragástrica y la inyección intraperitoneal de agua (1,2 ml). Medio, proporción de neuronas activadas por agua intraperitoneal e intragástrica. A la derecha, la respuesta de las neuronas individuales a la inyección de agua intraperitoneal se correlaciona positivamente con su respuesta a la inyección de agua intragástrica. f, Izquierda, trazos de ejemplo que muestran neuronas que muestran patrones de actividad opuestos después de la inyección de agua intraperitoneal (1,2 ml) y la inyección de solución salina hipertónica (NaCl 3 M, 0,12 ml). Medio, proporción de neuronas activadas por agua intraperitoneal e inhibidas por solución salina intraperitoneal. A la derecha, las respuestas de las neuronas individuales al agua intraperitoneal y la solución salina intraperitoneal están negativamente correlacionadas. Los datos son la media ± sem Las estadísticas se muestran en la Tabla 2 de datos ampliados.

Luego investigamos cómo se transmite la información sobre el balance de líquidos al VTA. Primero consideramos el hipotálamo lateral (LH), que está implicado en el comportamiento ingestivo34,35 y envía una proyección GABAérgica densa (productora de ácido γ-aminobutírico) al VTA36 (que puede activar las neuronas VTA-DA indirectamente a través de la inhibición de las neuronas GABAérgicas intermedias). en VTA37 (neuronas VTA-GABA)). Preparamos ratones para obtener imágenes de neuronas GABAérgicas en LH (neuronas LH-GABA) e infusión intragástrica y luego registramos cómo estas neuronas responden a los cambios en el equilibrio de líquidos. De manera similar a las neuronas VTA-DA, muchas neuronas LH-GABA se activaron después de la infusión de agua (Datos extendidos, Fig. 5a, b) y se inhibieron mediante la inyección de solución salina hipertónica (Datos extendidos, Fig. 5c). Para probar si el subconjunto de neuronas LH-GABA que se proyectan específicamente al VTA muestran estas respuestas, utilizamos una estrategia de rastreo retrógrado para obtener imágenes de la dinámica del calcio en las neuronas LH-GABA→VTA, lo que reveló que estas neuronas también se activan fuertemente después de la infusión intragástrica de agua (Datos extendidos Fig. 5d). Por lo tanto, las neuronas LH-GABA → VTA rastrean el equilibrio de líquidos y están preparadas para transmitir esta información al VTA.

Para probar si este circuito transmite información sobre el equilibrio de fluidos al VTA (Fig. 3a), primero medimos cómo la activación de las neuronas LH-GABA→VTA influye en la actividad de las neuronas VTA-GABA. La estimulación optogenética de las terminales LH-GABA en el VTA combinada con imágenes simultáneas de los cuerpos celulares de las neuronas VTA-GABA reveló que la activación de las neuronas LH-GABA → VTA induce una inhibición fuerte y prolongada en la mayoría de las neuronas VTA-GABA (Datos extendidos Fig. 5e) . Esto sugiere que la activación natural de las neuronas LH-GABA por el agua sería suficiente para modular la dinámica del VTA.

a, Un modelo de una posible vía anatómica que conecta las neuronas interoceptivas para el agua y los nutrientes con el VTA. b, Izquierda, esquema de microendoscopia simultánea de neuronas VTA-DA e inhibición quimiogenética (con hM4Di) de neuronas LH-GABA. Derecha, respuestas de la población (como se define en la Fig. 1) para las neuronas VTA-DA activadas (rojas) o inhibidas (azules) por solución salina o CNO, y después de la infusión de agua después de solución salina o CNO. c, Izquierda, esquema de imágenes de microendoscopio simultáneas de neuronas VTA-DA y activación quimiogenética (con hM3Dq) de neuronas de sed SFO. Medio, dinámica de neuronas VTA-DA individuales en respuesta a la infusión de agua después de la inyección de solución salina o CNO en ratones saciados. Derecha, respuestas de población de neuronas VTA-DA activadas (rojo) o inhibidas (azul) después de la infusión intragástrica. d, respuestas de población de neuronas VTA-DA activadas (rojo) o inhibidas (azul) después de la inyección intraperitoneal de agua. Deshidratado, deshidratado. Los datos son la media ± sem Las estadísticas se muestran en la Tabla 2 de datos ampliados.

Para probar si las neuronas LH-GABA son necesarias para que las neuronas VTA-DA rastreen los cambios en el equilibrio de fluidos, nos dirigimos al receptor inhibidor de diseño activado exclusivamente por drogas de diseño (DREADD) hM4Di a las neuronas LH-GABA mientras tomamos imágenes de las neuronas VTA-DA. La infusión de agua sola nuevamente provocó una fuerte activación de muchas neuronas DA (Fig. 3b). Es de destacar que el silenciamiento de las neuronas LH-GABA antes de la infusión intragástrica de agua bloqueó específicamente esta respuesta neuronal posterior de VTA-DA (Fig. 3b). Esto sugiere que las neuronas LH-GABA son la fuente de la señal que informa a las neuronas VTA-DA sobre el equilibrio de líquidos (Fig. 3a).

La información sobre el equilibrio de líquidos ingresa al cerebro a través de neuronas interoceptivas dedicadas, incluidas las neuronas glutamatérgicas en el órgano subfornical (SFO) que se activan directamente por la deshidratación27, impulsan la sed38,39,40,41,42,43 y están situadas aguas arriba de la LH en el circuito de sed40 (Fig. 3a). Para investigar si el SFO transmite información sobre el equilibrio de fluidos a las neuronas LH y sus objetivos VTA, dirigimos el excitador DREADD hM3Dq a las neuronas SFO que promueven la sed e imaginamos las respuestas de calcio en las neuronas VTA-DA. La inyección de N-óxido de clozapina (CNO) hizo que los ratones saciados bebieran vorazmente, lo que confirma la activación de la neurona SFO, pero la CNO solo tuvo un efecto sutil en la actividad neuronal VTA-DA al inicio (en ausencia de agua; Datos extendidos Fig. 6a), lo que indica que el SFO no es suficiente para impulsar la dinámica de la dopamina VTA. Por el contrario, CNO potenció la activación de las neuronas VTA-DA mediante la administración posterior de agua, imitando el efecto de la deshidratación natural (Fig. 3c, dy Datos extendidos Fig. 1q). Similar a la SFO, la estimulación de las neuronas AgRP que promueven el hambre44,45,46 no afectó la actividad de la neurona DA al inicio, pero moduló las respuestas posteriores a la absorción de los nutrientes internos (imitando el efecto de la privación de alimentos; datos extendidos Fig. 6c-f) . Juntos, esto indica que las neuronas SFO y AgRP controlan la magnitud de las respuestas de las neuronas DA a cambios relevantes en el estado interno, pero no transmiten directamente información sobre la hidratación y los nutrientes sistémicos.

Para probar si este efecto modulador de las neuronas SFO en el VTA se transmite a través de la LH, nuevamente dirigimos hM3Dq a las neuronas SFO que promueven la sed y luego tomamos imágenes de la dinámica del calcio en las neuronas LH-GABA → VTA. La estimulación quimiogenética de las neuronas SFO potenció la activación de las neuronas LH-GABA por infusión de agua intragástrica, similar al efecto de la deshidratación natural (Datos extendidos Fig. 6g) y como se observa en las neuronas VTA-DA (Fig. 3c, d). La activación de las neuronas SFO sola también provocó una modulación pequeña pero significativa de la actividad de las neuronas LH-GABA en la línea de base (Datos extendidos Fig. 6g). Juntos, estos hallazgos revelan que las neuronas SFO modulan las respuestas de dopamina al agua, al menos en parte, a través de efectos en las neuronas LH-GABA corriente arriba (Fig. 3a).

Para investigar cómo se transmite la información sobre fluidos y nutrientes desde el VTA a los circuitos posteriores, preparamos ratones para la infusión intragástrica y el registro de fotometría de fibra de dopamina extracelular usando GRAB-DA5 (Fig. 4a y Datos extendidos Fig. 7) en seis proyecciones densamente inervadas. objetivos de las neuronas VTA-DA36: la corteza prefrontal infralímbica (IL), la amígdala basolateral (BLA), el cuerpo estriado dorsal (DS) y tres subdivisiones del núcleo accumbens (NAc) (lateral (lat), capa medial (mSh) y núcleo). También preparamos ratones para grabaciones en el propio VTA para medir la liberación local de dopamina47,48,49. Luego medimos la liberación de dopamina en estos siete sitios (Datos extendidos Fig. 8a) en respuesta a una variedad de estímulos asociados con la ingestión, que incluyen comer y beber a su propio ritmo, así como infusiones intragástricas de nutrientes y líquidos.

a, Esquema que muestra la configuración y siete sitios de registro (círculos rojos) para medir la liberación de dopamina. b, Izquierda, registro de ejemplo del mSh que muestra la liberación de dopamina durante la fase oral de la ingestión de agua (30 s después del comienzo de lamer). Derecha, liberación media de dopamina en cada región registrada durante esta fase oral durante el consumo de agua (azul) y de Guarantee (naranja). c, Izquierda, registro de ejemplo de BLA que muestra la liberación de dopamina durante la fase gastrointestinal para Garantizar (primeros 12 minutos después de que comience la infusión intragástrica). Derecha, liberación media de dopamina en cada región registrada durante esta fase gastrointestinal durante la infusión de agua y de Guarantee. d, izquierda, registro de ejemplo de VTA que muestra la liberación de dopamina durante la fase sistémica del agua (12 a 50 min después del inicio de la infusión intragástrica). Derecha, liberación media de dopamina en cada región registrada durante esta fase sistémica después de la infusión de agua y Guarantee. e, Izquierda, esquema de imágenes específicas de proyección. Respuestas medias medias de las neuronas VTA-DA→BLA y las neuronas VTA-DA→mSh durante la infusión intragástrica de agua (fase gastrointestinal resaltada). Derecha, respuestas medias (puntuación z ponderada por población) de neuronas activadas que se proyectan a BLA y mSh. *P < 0,05. Los datos son media ± sem Las estadísticas se muestran en las Tablas de datos extendidos 2 y 3.

Esto reveló que la dopamina se libera en diferentes sitios del cerebro de una manera que rastrea el paso de nutrientes y líquidos a través de las etapas de ingestión (desde la boca hasta el tracto gastrointestinal y la sangre; Fig. 4b-d y Tabla de datos ampliados 3). Encontramos que los nutrientes y fluidos orales desencadenaron la liberación de dopamina en muchas regiones del cerebro que estaba bloqueada en el tiempo para lamer la comida y el agua, incluso en NAc, como se mostró anteriormente4,5. La detección posterior de agua en el tracto gastrointestinal se representó en múltiples áreas pero no en NAc, mientras que los nutrientes gastrointestinales desencadenaron la liberación de dopamina solo en BLA (Fig. 4c). Es de destacar que la liberación de dopamina en BLA aumentó durante decenas de segundos durante la bebida de una manera más consistente con el llenado gástrico que con la retroalimentación orosensorial inmediata (Datos extendidos Fig. 8f). Confirmamos con imágenes específicas de proyección que la liberación diferencial de dopamina en NAc y BLA en respuesta a señales gastrointestinales coincide con la dinámica del calcio del cuerpo celular de las neuronas VTA-DA que se proyectan a estas dos áreas (Fig. 4e y Datos extendidos Fig. 8e) .

Además de estas respuestas orales y gastrointestinales, observamos una tercera etapa posterior a la absorción que se caracterizó por una liberación prolongada de dopamina en el propio VTA (Fig. 4d). Esta liberación de dopamina (presumiblemente somatodendrítica47,48,49) aumentó gradualmente después de beber a su propio ritmo o de una infusión de agua intragástrica, permaneció elevada durante decenas de minutos y se vio potenciada por la privación previa de agua (Datos ampliados, Fig. 8c). También se observó la liberación de dopamina en VTA (pero con un inicio más rápido) después de la inyección intraperitoneal de agua (Datos ampliados Fig. 8d), y el curso temporal de la liberación de dopamina por las neuronas VTA-DA en respuesta al agua administrada por estas diversas rutas reflejadas la dinámica del calcio de una gran subpoblación de neuronas VTA-DA (Fig. 1), que a su vez rastreaba la rehidratación sistémica. Además del VTA, también observamos la liberación de dopamina en DS durante y después de la infusión intragástrica de agua (Fig. 4c, d y Datos extendidos Fig. 8b, c, f). Juntos, estos hallazgos revelan que el sistema de dopamina está organizado de tal manera que las diferentes etapas de ingestión desencadenan preferentemente la liberación de dopamina en distintos subconjuntos de objetivos posteriores.

Muchos animales obtienen su agua de diversas fuentes, incluidos los alimentos9,10,11,12,13,14,15, y por lo tanto deben aprender qué alimentos y líquidos los rehidratan a través de la experiencia de ingestión. Consideramos la posibilidad de que la activación de las neuronas dopaminérgicas por rehidratación sistémica pudiera estar involucrada en este proceso de aprendizaje. Es de destacar que, aunque las recompensas de agua se usan ampliamente para entrenar animales50, los intentos de eludir el consumo normal de alcohol e impulsar el comportamiento operante con fluidos intragástricos solos no han tenido éxito51,52. Sin embargo, razonamos que los cambios en el equilibrio de líquidos podrían ser más eficientes para impulsar el aprendizaje sobre señales orales como los sabores, ya que estas dos modalidades están estrechamente acopladas durante la ingestión normal.

Para probar esta idea, desarrollamos un sistema de circuito cerrado para acoplar el lamido a la infusión intragástrica, de modo que el sabor y la capacidad de rehidratación de una solución ingerida pudieran variar de forma independiente (Fig. 5a; inspirado en estudios previos de acondicionamiento del sabor de nutrientes8,22, 53,54,55,56). Programamos este sistema de manera que cada lamida de una solución con sabor desencadenara una infusión intragástrica de un volumen igual de solución salina, y cada lamida de una solución con sabor diferente desencadenara una infusión intragástrica de un volumen igual de agua. Como resultado, el consumo de una sola solución rehidrata, pero esto no se puede anticipar inicialmente sobre la base del sabor.

a, Esquema del sistema de circuito cerrado para el entrenamiento de preferencia de fluidos. Los ratones se hidratan con el consumo de una solución con sabor (sabor A) y se deshidratan levemente con otra (sabor B) a través de una infusión intragástrica de agua o solución salina que se desencadena al lamerse. b, Preferencia por el sabor A antes y después del entrenamiento. c, Cambios en el consumo total en el primer y último día de entrenamiento. d, Izquierda, fluorescencia GRAB-DA en mSh y BLA durante el consumo de la solución deshidratante en el primer y último día de entrenamiento. A la derecha, diagramas de resumen de las respuestas GRAB-DA activadas por lamer en el primer y último día de entrenamiento con cada solución. e, la inhibición selectiva de las neuronas VTA-DA durante el entrenamiento después de que se eliminó el acceso al agua (minutos 10 a 60) elimina el aprendizaje de preferencias en ratones que expresan GtACR pero no en los controles mCherry. Los datos son la media ± sem. Las estadísticas se muestran en la Tabla 4 de datos ampliados.

Primero determinamos las preferencias en la línea de base dando a los ratones una prueba de dos botellas con estos sabores en ausencia de infusión intragástrica. Luego, los ratones fueron entrenados proporcionando acceso aislado a cada solución (que ahora activaba la infusión intragástrica) durante tres sesiones de una hora en días consecutivos. Después del entrenamiento, los ratones fueron evaluados nuevamente con una prueba de dos botellas en ausencia de infusión para medir cualquier cambio aprendido en la preferencia. Esto reveló que los ratones aprenden a preferir soluciones combinadas con infusión de agua, según lo medido por la prueba de dos botellas (Fig. 5b y Tabla de datos extendidos 4) y el consumo durante el entrenamiento (Fig. 5c y Datos extendidos Fig. 9a), que fue acompañado por cambios en la liberación de dopamina desencadenada por el consumo tanto en NAc como en BLA (Fig. 5d y Datos extendidos Fig. 10). Esto indica que los cambios lentos y retrasados ​​en el equilibrio de líquidos pueden impulsar un aprendizaje sólido y cambios en la liberación de dopamina, cuando se combinan con una señal oral adecuada.

Para probar si la actividad de las neuronas DA es necesaria para este proceso de aprendizaje, utilizamos la opsina inhibitoria stGtACR2 para silenciar las neuronas VTA-DA durante el entrenamiento, lo que bloqueó la adquisición de preferencia de fluidos (Datos extendidos Fig. 9b). Sin embargo, las neuronas VTA-DA se activan tanto por señales orales como posteriores a la ingestión (Fig. 1). Para probar específicamente la función de la actividad de la neurona DA posterior a la ingestión, modificamos el protocolo de entrenamiento para que los ratones tuvieran acceso a cada líquido durante solo 10 minutos por sesión de entrenamiento (separando así en el tiempo el consumo de agua de sus efectos posteriores a la absorción, que comienzan aproximadamente 10 min después del inicio de la bebida) (Datos extendidos Fig. 1d). Los ratones aprendieron sólidamente a preferir el sabor asociado con la infusión de agua usando este nuevo protocolo (Datos extendidos Fig. 9c), lo que nos permitió probar el papel de las señales posteriores a la ingestión al silenciar optogenéticamente las neuronas VTA-DA solo después de que se eliminó el acceso al agua. El silenciamiento de las neuronas VTA-DA durante esta fase posterior a la absorción fue suficiente para bloquear la adquisición de la preferencia aprendida (Fig. 5e). Esto revela que la activación de las neuronas VTA-DA por la hidratación sistémica es necesaria para conocer las consecuencias de la ingestión de líquidos, incluso cuando esta activación se produce después del cese del consumo.

Aquí hemos demostrado que incrustados dentro del sistema de dopamina mesolímbico hay múltiples subsistemas que rastrean las consecuencias internas posteriores a la ingestión de comer y beber. Descubrimos que los cambios en el equilibrio de líquidos tienen efectos particularmente fuertes en la dinámica del calcio de las neuronas DA, lo que nos llevó a investigar cómo las señales de hidratación se comunican al sistema de dopamina y se utilizan para el aprendizaje. Esto reveló que las neuronas GABAérgicas en la LH transmiten información sobre la hidratación sistémica al VTA, mientras que las neuronas que promueven la sed en el SFO controlan la ganancia de esta señal. Además, demostramos que la dopamina se libera en diferentes sitios posteriores en respuesta a la detección de alimentos y líquidos en etapas progresivas de ingestión. Probamos la función de estas señales utilizando un paradigma conductual que desacopla los efectos orales y sistémicos de los fluidos ingeridos, lo que reveló que la rehidratación posterior a la ingestión por sí sola puede impulsar un aprendizaje sólido y que esto requiere neuronas VTA-DA. Esto expone una lógica organizativa mediante la cual la ingestión de alimentos y agua y sus efectos posteriores sobre el estado interno se representan de manera diferencial en el sistema de dopamina y se utilizan para el aprendizaje.

Los estudios previos del sistema de dopamina y los fluidos se han centrado en la bebida y las respuestas agudas a las señales de agua4,19,57,58. Examinamos los cambios en el equilibrio de líquidos en escalas de tiempo más largas y descubrimos que la deshidratación y la rehidratación sistémica desencadenan la inhibición y activación, respectivamente, de muchas neuronas VTA-DA. Estas respuestas rastrean los cambios en la osmolaridad de la sangre, persisten durante decenas de minutos, son independientes del método de administración de líquidos y se correlacionan con la liberación local de dopamina en el VTA. La función de la liberación de dopamina somatodendrítica es poco conocida, pero está espacialmente localizada, controlada por patrones de activación únicos y maquinaria sináptica47,49, y tiene el potencial de activar la actividad de subconjuntos de neuronas DA específicas y entradas47,59,60. Juntos, estos hallazgos revelan que los cambios en el equilibrio de fluidos modulan no solo las respuestas de las neuronas DA a las señales de agua61, sino que también modulan directamente el sistema en su conjunto.

A diferencia de los líquidos, varios estudios han informado que los nutrientes ingeridos desencadenan la liberación de dopamina en el cuerpo estriado62,63,64,65,66, y detectamos un aumento sutil de la dopamina en NAc mSh (pero no en el núcleo o lateral NAc o DS) después de que los nutrientes entregado al estómago (Fig. 4d). Sin embargo, encontramos inesperadamente que los nutrientes intragástricos desencadenaron el nivel más alto de liberación de dopamina en BLA durante la fase gastrointestinal y sistémica (Fig. 4c, d). El BLA es bien conocido por procesar información de nutrientes67 y trabajos anteriores han demostrado que las lesiones de BLA68 o la farmacología55 pueden bloquear el aprendizaje del sabor. Estos hallazgos priorizan una mayor investigación de la vía VTA→BLA para comprender cómo las señales de nutrientes internos impulsan el aprendizaje sobre los alimentos.

Aprender sobre alimentos y líquidos requiere unir múltiples escalas de tiempo de señales. El sistema de dopamina es bien conocido por su papel en el aprendizaje de las relaciones entre las señales externas y las recompensas gustativas19,20, como la vista del agua y su sabor. Sin embargo, el sabor del agua es en sí mismo una señal que predice un cambio tardío en el equilibrio de líquidos, y no está claro si los animales aprenden tales relaciones y cómo lo hacen. Aquí hemos demostrado que los animales pueden aprender a asociar los sabores con la rehidratación corporal retardada, que activa las neuronas VTA-DA, y que esta actividad retardada es necesaria para el aprendizaje. Esto identifica una vía clave que permite a los animales aprender qué alimentos y líquidos consumir para mantenerse hidratados. La investigación adicional de este circuito puede revelar los principios de cómo el cerebro salva la brecha entre las señales transitorias asociadas con la ingestión y los efectos fisiológicos retardados.

Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, San Francisco, siguiendo la Guía NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

Los experimentos utilizaron ratones adultos (> 6 semanas de edad) de ambos sexos, alojados en instalaciones con temperatura y humedad controladas con ciclos de luz y oscuridad de 12 h y acceso ad libitum a agua y comida estándar (PicoLab 5053). Obtuvimos ratones DAT-ires-cre (B6.SJL-Slc6a3tm1.1(cre)Bkmn, Jackson cat. no. 006660) y Vgat-ires-cre (Slc32a1tm2(cre)Lowl, Jackson #016962) de Jackson Labs. Ratones knock-in Vgat-ires-flp (B6.Cg-Slc32a1tm2.1(flop)Hze) y ratones knock-in Npy-ires-flp (B6.Cg-Npytm1.1(flop)Hze) del Allen Institute for Ciencia del cerebro. Los ratones knock-in DAT-ires-cre se cruzaron con ratones knock-in Vgat-ires-flp o con ratones knock-in Npy-ires-flp para generar mutantes dobles.

Para todos los comportamientos y grabaciones, los ratones se colocaron en cámaras de comportamiento con aislamiento acústico (Coulbourn Habitest Modular System) exclusivamente durante el ciclo de oscuridad. Las cámaras se limpiaron entre experimentos para eliminar cualquier señal olfativa restante de experimentos anteriores. Todos los ratones se habituaron durante al menos 1 h a la cámara de comportamiento (con el equipo de registro y el catéter intragástrico conectados simultáneamente) antes de usarlos para cualquier experimento en los días posteriores. Los ratones se volvieron a habituar adicionalmente a la cámara de comportamiento durante 10 a 20 minutos al comienzo de cada sesión de prueba (durante la cual se encendió el LED utilizado para la obtención de imágenes, para reducir cualquier artefacto de blanqueo inicial al comienzo de la grabación).

Para los experimentos de respuesta a lamer, los ratones se privaron de agua (para experimentos que usaban agua o consumo de NaCl 300 mM) o de alimentos (para experimentos que usaban el consumo de Asegurar) durante 24 h antes del experimento. Luego, a los ratones se les dio acceso a un lickómetro que contenía la solución apropiada (agua, Asegúrese o soluciones de NaCl 300 mM) durante un total de 5 minutos, que se definió como comenzando con el primer lametón (para controlar el hecho de que algunos ratones tenían una mayor latencia para beber). El acceso se terminó retirando la botella de la cámara, con cuidado para evitar que quedaran señales olfativas (por ejemplo, limpiando las gotas). Los experimentos que midieron las respuestas al consumo de NaCl 300 mM se realizaron solo en ratones ingenuos, porque los animales pueden aprender a evitar las soluciones hipertónicas después de una sola experiencia69. Todos los ratones se habituaron inicialmente al lickómetro y la configuración de grabación al proporcionarles acceso a una botella que contenía agua durante una hora con la cámara del microendoscopio conectada.

Las inyecciones intraperitoneales se realizaron en el lado derecho del ratón. Para registrar las respuestas a las inyecciones intraperitoneales solas, las grabaciones continuaron durante 30 minutos después de la inyección. Para registrar la modulación de la respuesta mediante la activación de DREADD, la inyección de CNO fue seguida de una infusión intragástrica posterior o una inyección intraperitoneal después de 5 min (ver más abajo). Usamos las siguientes dosis como se indica en las leyendas de las figuras: 1,2 ml de agua, 0,6 ml de glucosa al 50%, 0,12 ml de NaCl 3 M y 1,2 ml de NaCl 154 mM (solución salina isotónica). A los ratones se les administró una inyección intraperitoneal simulada un día antes de usarlos para estos experimentos para habituarlos.

Las inyecciones intravenosas se realizaron mediante la inyección de solución salina hipertónica (100 μl, NaCl 1 M) en la vena lateral de la cola, mientras que el ratón se mantuvo en un sistema de sujeción hecho a medida que permite la obtención de imágenes concurrentes. Los ratones se habituaron durante 30 minutos a la configuración antes de que comenzara el experimento. Para registrar las respuestas a las inyecciones intravenosas, las grabaciones continuaron durante 30 minutos después de la inyección. Los animales no fueron anestesiados durante estos experimentos.

Las infusiones intragástricas se administraron a una velocidad de 100 o 200 μl min−1 utilizando una bomba de jeringa (Harvard Apparatus 70–2001), durante 6 o 12 min (lo que resultó en un volumen total infundido de 0,6 o 1,2 ml). Se prepararon soluciones de NaCl (154 ó 300 mM), glucosa (25%) y Ensure utilizando agua desionizada. Anteriormente, medimos la latencia de los fluidos para pasar a través del catéter intragástrico en aproximadamente 13 s a una velocidad de infusión20 de 200 μl min−1. Para los experimentos de infusión, el catéter intragástrico se conectó a la bomba de la jeringa mediante adaptadores y tubos de plástico (AAD04119, Tygon; LS20, Instech) antes de colocar a los ratones en la cámara de comportamiento.

La deferenciación vagal se realizó inyectando ratones preparados para imágenes microendoscópicas de neuronas VTA-DA (ver la sección a continuación) con 50 mg kg-1 de capsaicina. Los ratones se mantuvieron bajo anestesia con isoflurano durante 1 h comenzando inmediatamente antes de la inyección para evitar dolor innecesario, de acuerdo con los protocolos publicados previamente70. La eficacia de la desaferenciación se determinó analizando el número de toallitas para los ojos en los 15 s posteriores a la administración ocular de capsaicina al 0,1 % (en comparación con los ratones que se sometieron a la misma cirugía de desaferenciación pero recibieron una inyección de solución salina; Datos ampliados, Fig. 5f).

Los catéteres intragástricos se instalaron siguiendo nuestros protocolos publicados20,24. En resumen, se conectaron catéteres veterinarios de acceso estéril (C30PU-RGA1439, Instech Labs) a botones de acceso vascular estéril (VABM1B/22, 22, Instech Labs). Los ratones se anestesiaron con ketamina-xilazina, el catéter se implantó quirúrgicamente en el estómago avascular y el puerto del botón de acceso se aseguró a la espalda del ratón (con el puerto mirando hacia afuera, es decir, dorsalmente). Se colocó una tapa protectora de aluminio (VABM1C, Instech Labs) sobre el puerto para protegerlo entre experimentos. Se permitió que los ratones se recuperaran durante una semana después de la cirugía intragástrica antes del comienzo de los experimentos.

Los ratones se prepararon para grabaciones con microendoscopio utilizando los procedimientos generales que hemos informado20. En resumen, en la primera cirugía, se inyectó a los ratones un virus adenoasociado (AAV) que expresaba un GCaMP y se introdujo una lente GRIN en el cerebro. Cuatro semanas más tarde, los ratones se sometieron a una segunda cirugía en la que se colocó una placa base (Inscopix 100-000279) sobre la lente y se fijó con cemento adhesivo (MetaBond) y luego se cubrió después de la cirugía con una cubierta de placa base (Inscopix 100-000241). La mayoría de los animales se sometieron luego a una tercera cirugía para instalar un catéter intragástrico para infusiones de fluidos en el estómago. Los detalles de cada cohorte se encuentran a continuación.

Se prepararon ratones DAT-cre (n = 14) para obtener imágenes inyectando AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl; 7,2 × 1012 copias del genoma viral (vg) ml−1; Addgene) en el VTA izquierdo ( −3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV) e instalando una lente GRIN (6,1 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004610) 0,15 mm por encima del sitio de inyección en la misma cirugía. En cirugías posteriores, cada ratón se colocó en placa base y luego se equipó con un catéter intragástrico.

Se prepararon ratones VGAT-cre (n = 5) para obtener imágenes mediante la inyección de AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl; 7,2 × 1012 vg ml-1; Addgene) en la LH izquierda (-1,5 mm AP, +1,0 mm ML, −5,1 mm DV) e instalando una lente GRIN (8,3 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004611) 0,15 mm por encima del sitio de inyección en la misma cirugía. En cirugías posteriores, cada ratón recibió una placa base y luego se equipó con un catéter intragástrico.

Se prepararon ratones VGAT-cre (n = 3) para obtener imágenes mediante la inyección de AAV1-Ef1a-fDIO-GCaMP6m (300 nl; 2 × 1012 vg ml−1; Janelia Vector Core) en el LH ​​izquierdo (−1,5 mm AP, +1,0 mm ML, −5,1 mm DV), CAV2-Flx-Flp (300 nl; 6 × 1012 vg ml−1; Plateforme de Vectorologie) en VTA izquierdo (−3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV) y instalando una lente GRIN (8,3 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004611) 0,15 mm por encima del sitio de inyección LH. En cirugías posteriores, cada ratón se colocó en placa base y luego se equipó con un catéter intragástrico.

Se prepararon ratones VGAT-cre (n = 3) para obtener imágenes mediante la inyección de AAV5-hSyn-DIO-ChrimsonR-tdTomato (300 nl; 4,4 × 1012 vg ml-1; Addgene) en la LH izquierda (-1,5 mm AP, +1,0 mm ML, −5,1 mm DV); AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl; 7,2 × 1012 vg ml−1; Addgene) en el VTA izquierdo (−3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV) e instalando una lente GRIN (6,1 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004610) 0,15 mm por encima del sitio de inyección en la misma cirugía. Para estimular durante la grabación, se entregó un LED de 620 nm a través de la cámara nVoke 2.0 (potencia de LED de 15 mW mm−2, frecuencia de pulso de 20 Hz, ancho de pulso de 1 ms, ciclo de 2 s ON y 3 s OFF).

Se prepararon ratones DAT-cre::VGAT-Flp (n = 6) para obtener imágenes inyectando AAVDJ-hSyn-fDIO-hM4Di-mCherry (400 nl; 1,1 × 1013 vg ml-1; Stanford) bilateralmente en la LH (-1,5 mm AP, ± 1,0 mm ML, -5,1 mm DV); AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl; 7,2 × 1012 vg ml-1; Addgene) en el VTA izquierdo (-3,1 mm AP, +0,5 mm ML, -4,5 mm DV); e instalando una lente GRIN (6,1 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004610) 0,15 mm por encima del sitio de inyección en la misma cirugía. En cirugías posteriores, cada ratón se colocó en placa base y luego se equipó con un catéter intragástrico.

Se prepararon ratones DAT-cre (n = 3) para obtener imágenes inyectando AAV2-CamKIIa-HA-hM3Dq-ires-mCitrine (100 nl; 2 × 1012 vg ml-1; UNC Vector Core) en el SFO (-0,6 mm AP , 0 mm ML, −2,8 mm DV); AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl; 7,2 × 1012 vg ml-1; Addgene) en el VTA izquierdo (-3,1 mm AP, +0,5 mm ML, -4,5 mm DV); e instalando una lente GRIN (6,1 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004610) 0,15 mm por encima del sitio de inyección en la misma cirugía. Para confirmar la expresión funcional de hM3D, a los ratones se les inyectó CNO o solución salina (100 μl) y luego se les dio acceso al agua durante 5 min (Datos extendidos Fig. 6a). En cirugías posteriores, cada ratón recibió una placa base y luego se equipó con un catéter intragástrico.

Se prepararon ratones DAT-cre::NPY-Flp (n = 3) para obtener imágenes inyectando AAV1-Ef1a-fDIO-hM3Dq-mCherry (200 nl; 3 × 1012 vg ml−1; Stanford) en el ARC bilateralmente (−1,75 mm AP, ± 0,2 mm ML, -5,9 mm DV); AAV5-Syn-FLEX-GCaMP6f-WPRE-SV40 (300 nl; 7,2 × 1012 vg ml−1; Addgene) en el VTA izquierdo (−3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV) e instalar un GRIN lente (6,1 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004610) 0,15 mm por encima del sitio de inyección en la misma cirugía. Para confirmar la expresión funcional de hM3D, a los ratones se les inyectó CNO o solución salina (100 μl) y se registró el consumo de Guarantee durante 5 min (Datos extendidos Fig. 6c). En cirugías posteriores, cada ratón recibió una placa base y luego se equipó con un catéter intragástrico.

Se prepararon ratones VGAT-cre (n = 4) para obtener imágenes inyectando AAV2-CamKIIa-HA-hM3Dq-ires-mCitrine (100 nl; 2 × 1012 vg ml-1; UNC Vector Core) en el SFO (-0,6 mm AP , 0 mm ML, −2,8 mm DV), AAV1-Ef1a-fDIO-GCaMP6m (300 nl; 2 × 1012 vg ml−1; Janelia Vector Core) en la LH izquierda (−1,5 mm AP, +1,0 mm ML, − 5,1 mm DV) y CAV2-Flx-Flp (300 nl; 6 × 1012 vg ml−1; Plateforme de Vectorologie) en VTA izquierdo (−3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV). Se implantó una lente GRIN (8,3 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004611) 0,15 mm por encima del sitio de inyección de LH en la misma cirugía. En cirugías posteriores, cada ratón recibió una placa base y luego se equipó con un catéter intragástrico.

Se prepararon ratones DAT-cre (n = 3) para obtener imágenes inyectando AAV1-Ef1a-fDIO-GCaMP6m (300 nl; 2 × 1012 vg ml−1; Janelia Vector Core) en el VTA izquierdo (−3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV) y CAV2-Flx-Flp (100 nl; 6 × 1012 vg ml−1; Plateforme de Vectorologie) en NAc mSh izquierdo (+1,3 mm AP, +0,5 mm ML, −4,4 mm DV) . Se implantó una lente GRIN (6,1 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004610) 0,15 mm por encima del sitio de inyección del VTA en la misma cirugía. En cirugías posteriores, cada ratón recibió una placa base y luego se equipó con un catéter intragástrico.

Se prepararon ratones DAT-cre (n = 3) para obtener imágenes inyectando AAV1-Ef1a-fDIO-GCaMP6m (300 nl; 2 × 1012 vg ml−1; Janelia Vector Core) en el VTA izquierdo (−3,1 mm AP, +0,5 mm ML, −4,5 mm DV) y CAV2-Flx-Flp (200 nl; 6 × 1012 vg ml−1; Plateforme de Vectorologie) en BLA izquierda (−1,8 mm AP, +2,9 mm ML, −4,7 mm DV). Se implantó una lente GRIN (6,1 × 0,5 mm; Inscopix 1050-004610) 0,15 mm por encima del sitio de inyección del VTA en la misma cirugía. En cirugías posteriores, cada ratón se colocó en placa base y luego se equipó con un catéter intragástrico.

Los videos de microendoscopia se adquirieron a 8 Hz (potencia de LED de 0,6–0,8 mW mm−2 de 455 nm, ganancia de 8,0, reducción de resolución espacial 2×) mediante el software Inscopix (Software de adquisición de datos v. 151; https://support.inscopix.com/support /products/nvista-30-and-nvoke-20/data-acquisition-software-v151). Después de la adquisición, los videos primero se preprocesaron, espacialmente (factor de binning de 2) y temporalmente (factor de binning de 2), se submuestrearon, se sometieron a un filtro de paso de banda espacial (para eliminar el ruido y las células desenfocadas) y se corrigió el movimiento. utilizando el software de procesamiento de datos de Inscopix (v1.3.1, https://support.inscopix.com/support/products/data-processing-software/inscopix-data-processing-v131). Los videos se eliminaron si se producía un movimiento excesivo (más grande que el diámetro de la neurona promedio en cualquier dirección) que no podía abordarse con una corrección de movimiento adicional. A continuación, se extrajeron los rastros de actividad de las neuronas individuales de estos videos utilizando la tubería de factorización de matriz no negativa restringida (CNMF-E) (http://www.github.com/zhoupc/cnmfe) implementada en MATLAB. Después de la segmentación inicial de CNMF-E, las neuronas extraídas se refinaron manualmente para evitar artefactos de movimiento no corregidos, duplicación de regiones de interés y sobresegmentación de los mismos componentes espaciales. Se eliminaron las neuronas si se producían artefactos de blanqueo grandes (que se ajustaban a una función de decaimiento exponencial definida) durante el período de referencia de 10 min. Para cada experimento, los rastros de actividad de las neuronas individuales se extrajeron de las grabaciones de 3 a 6 ratones y luego se agruparon para el análisis posterior. Podríamos alinear fácilmente las celdas entre sesiones de grabación separadas por dos semanas. Esto se basó en un software personalizado combinado con la verificación manual de todas las alineaciones.

La aceleración de la cabeza se adquirió utilizando el software Inscopix (Data Acquisition Software v. 151) del acelerómetro de 3 ejes integrado en las cámaras nVoke/nVista, que proporcionó datos de aceleración xyz a una resolución temporal de 50 Hz.

El consumo de fluidos se monitoreó con un lickómetro capacitivo y se registró usando nVista/nVoke (v. 3.0 nVista system; v. 2.0 nVoke system; https://support.inscopix.com/support/products/nvista-30/nvista-30) sistemas y software de adquisición de datos (Software de adquisición de datos v. 151; https://support.inscopix.com/support/products/nvista-30-and-nvoke-20/data-acquisition-software-v151) durante experimentos de imágenes con microendoscopio.

Se prepararon ratones de tipo salvaje (C57BL/6J, Jackson cat. n.º 000664) para registros de fotometría inyectando AAV9-hSyn-GRAB-DA1h (200 nl; 1,8 × 1013 vg ml−1; Janelia Vector Core) en los siguientes sitios : VTA izquierdo (n = 10 ratones; -3,1 mm AP, +0,5 mm ML, -4,5 mm DV), BLA (n = 12 ratones; -1,8 mm AP, +2,9 mm ML, -4,7 mm DV), IL PFC (n = 13 ratones; +1,7 mm AP, +0,3 mm ML, -2,85 mm DV), DS (n = 8 ratones; +1,5 mm AP, +1,5 mm ML, -3,5 mm DV); NAc mSh (n = 14 ratones; +1,3 mm AP, +0,5 mm ML, −4,4 mm DV), núcleo NAc (n = 7 ratones; +1,4 mm AP, +1,0 mm ML, −4,5 mm DV) o lateral NAc (n = 8 ratones; +1,0 mm AP, +1,75 mm ML, −5,0 mm DV). En la misma cirugía, se instaló una fibra óptica (0,4 mm de diámetro interior por 3,5, 5,4 o 6,3 mm de longitud; lentes dóricas, MFC_400/430-0,48) 0,1 mm por encima del lugar de la inyección. Después de permitir al menos una semana para recuperarse de la cirugía intracraneal, los ratones se sometieron a una segunda cirugía para instalar un catéter intragástrico como se describe anteriormente.

Para la adquisición de la señal GRAB-DA, los ratones implantados se ataron a un cable de conexión (Doric Lenses, MFP_400/460/900-0.48_2m_FCM-MF2.5). El LED azul continuo de 6 mW (470 nm) y el LED UV (405 nm) sirvieron como fuentes de luz de excitación. Estos LED fueron activados por un concentrador multicanal (Thorlabs), modulados a 211 Hz y 511 Hz respectivamente, y enviados a un minicubo filtrado (Doric Lenses, FMC6_AE(400–410)_E1(450–490)_F1(500–540)_E2 (550–580)_ F2(600–680)_S) antes de conectar a través de fibras ópticas (Doric Lenses, MFC_400/430-0.48). Las señales GRAB-DA GFP y las señales isosbésticas UV se recogieron a través de estas mismas fibras en un fotorreceptor de silicio de femtovatios (Newport, 2151). Las señales digitales se muestrearon a 1,0173 kHz, se demodularon, se amplificaron con bloqueo, se enviaron a través de un procesador (RZ5P, Tucker-Davis Technologies) y se recopilaron mediante Synapse (TDT). Después del experimento, estos datos se exportaron a través del navegador (TDT) y en MATLAB se redujeron temporalmente a 4 Hz. Todos los rastros de fotometría graficados en este documento son un promedio de dos rastros replicados para el mismo ratón (realizados dentro de las 2 semanas de diferencia), con la excepción del consumo de NaCl 300 mM que solo se puede probar una vez cuando los ratones son ingenuos. En algunos casos, los ratones se eliminaron del estudio debido a problemas de salud antes de que pudieran probarse con todos los estímulos y, como resultado, algunas comparaciones por pares no son posibles para todos los ratones de la cohorte.

El consumo de fluidos también se monitoreó con un lickómetro eléctrico y se registró con el software Synapse (TDT), y luego se exportó a través del navegador (TDT) y se analizó en MATLAB.

Para el registro de fotometría GRAB-DA durante el entrenamiento de preferencia de fluidos, se restringió el acceso a las soluciones saborizadas durante un período de referencia de 10 minutos al comienzo del registro (esto se sumó al período de aclimatación de 10 a 20 minutos mencionado anteriormente).

Preparamos ratones para la activación o inhibición quimiogenética in vivo como se describe anteriormente. Se administró CNO (1 mg kg−1, 100 μl) o vehículo (DMSO al 0,6 % en solución salina) mediante inyección intraperitoneal.

A los ratones se les restringió el agua continuamente al proporcionarles 1 ml de agua por día (además del agua obtenida durante las pruebas y el entrenamiento) y se retiraron del estudio si su peso corporal caía por debajo del 85 % del peso corporal inicial. Los ratones fueron evaluados y entrenados utilizando un protocolo de diez días basado en procedimientos similares para el acondicionamiento del sabor de nutrientes22. En resumen, la preferencia inicial por las soluciones se determinó mediante una prueba de dos botellas durante los primeros dos días. El entrenamiento se llevó a cabo durante los siguientes seis días, después de lo cual se reevaluó la preferencia. Los ratones se aclimataron a la cámara de comportamiento durante 10 a 20 minutos antes de que las soluciones saborizadas fueran accesibles. Se utilizó aproximadamente el mismo número de ratones machos y hembras para todos los experimentos de entrenamiento de preferencia de fluidos. Se colocaron catéteres para infusión intragástrica en los ratones durante todos los experimentos (incluidas las pruebas con dos botellas). A los ratones se les quitó la restricción de agua inmediatamente después del protocolo de entrenamiento de diez días y se les permitió recuperarse durante una semana.

Durante el entrenamiento, a los ratones se les dio acceso aislado a una de las dos soluciones con sabor, que activaron la infusión intragástrica cuando se consumieron. Los ratones se separaron en cuatro grupos. Durante los primeros tres días de entrenamiento, al primer grupo se le dio acceso durante 1 h a una solución que contenía Grape Kool-Aid sin azúcar al 0,05 % (Kraft Foods) mezclada con sacarina al 0,025 %. El consumo de esta solución, medido con un lickómetro eléctrico, provocó una infusión intragástrica de 1 μl de NaCl 600 mM. Durante los siguientes tres días consecutivos, la solución se reemplazó con una solución que contenía 0,05 % de Kool-Aid de limón y lima sin azúcar (Kraft Foods) mezclada con 0,025 % de sacarina, que provocó una infusión intragástrica de 1 μl de agua cuando se consumió. El segundo grupo pasó por el mismo entrenamiento, pero se invirtió el orden de los sabores. El tercer y cuarto grupo siguieron los mismos protocolos que los grupos uno y dos respectivamente, pero en su lugar, la uva se asoció con una infusión de agua y la cal se asoció con una infusión de NaCl 600 mM. En resumen, los grupos fueron los siguientes. Grupo 1: infusión de uva→NaCl (días 1-3); infusión de cal→agua (días 4-6); grupo 2: infusión de cal→agua (días 1-3); infusión de uva→NaCl (días 4-6); grupo 3: infusión de uva→agua (días 1-3); infusión de cal→NaCl (días 4-6); grupo 4: infusión de cal→NaCl (días 1-3); infusión de uva→agua (días 4-6).

Las preferencias iniciales y adquiridas se determinaron utilizando pruebas de dos botellas en dos días posteriores antes y después del entrenamiento (cuatro días en total). La colocación de la solución con sabor (en la parte delantera o trasera de la jaula) se aleatorizó el primer día y se invirtió el segundo día de la prueba de dos botellas.

Para las pruebas de dos botellas, a los ratones se les dio acceso durante 1 h a dos soluciones que contenían Kool-Aid sin azúcar al 0,05 %, ya sea lima-limón o uva (Kraft Foods), mezcladas con sacarina al 0,025 %. La preferencia por la solución de cal se calculó mediante la fórmula (lameduras de cal/lameduras totales). El consumo de fluidos se monitoreó con un lickómetro eléctrico y se registró con el software Synapse (TDT), y luego se exportó a través del navegador (TDT) y se analizó en MATLAB.

Para algunos experimentos (Fig. 5e y datos extendidos, Fig. 9c), se otorgó acceso por un tiempo limitado durante el entrenamiento. Estos experimentos se realizaron de acuerdo con el mismo protocolo anterior, pero el acceso a la solución saborizada se eliminó 10 minutos después del primer lametón durante cada día de entrenamiento.

Para silenciar VTA-DA durante el entrenamiento de preferencia de fluidos (datos extendidos, figura 9b), AAV8-hSyn-DIO-stGtACR2-fRED (400 nl, 7,9 × 1012 vg ml−1; Stanford) o AAV5-Ef1a-DIO-mCherry (400 nl, 7,3 × 1012 vg ml−1; UNC Vector Core) en el VTA de forma bilateral (−3,1 mm AP, ± 0,5 mm ML, −4,5 mm DV) y una fibra óptica con un diámetro interior de 200 μm (Thorlabs FT200UMT , CFLC230-10) se colocó 0,30 mm por encima y entre los sitios de inyección (-3,1 mm AP, 0 mm ML, -4,2 mm DV) en la misma cirugía en ratones DAT-cre (n = 11 ratones). Durante el período de entrenamiento, un láser DPSS de 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century BL473-100FC) fue controlado por el software Graphic State (v.4.2, http://www.coulbourn.com/category_s/363.html) a través de un Generador de señal TTL (Coulbourn H03-14) y sincronizado con disponibilidad de botella. Se midió que la potencia del láser era de ~1 a 2 mW en la punta del cable de conexión y se entregó de forma continua durante la hora experimental.

Para el silenciamiento retardado de VTA-DA durante el entrenamiento de preferencia de fluidos (Fig. 5e), AAV8-hSyn-DIO-stGtACR2-fRED (400 nl, 7.9 × 1012 vg ml−1; Stanford) o AAV5-Ef1a-DIO-mCherry (400nl, 7,3 × 1012 vg ml−1; UNC Vector Core) en el VTA de forma bilateral (−3,1 mm AP, ± 0,5 mm ML, −4,5 mm DV) y dos fibras ópticas con un diámetro interior de 200 μm (Thorlabs FT200UMT, CFLC230-10) se colocaron en un ángulo de 100 μm de los 2 sitios objetivo en la misma cirugía en ratones DAT-cre (n = 12 ratones). Durante el período de entrenamiento, se encendió un láser DPSS de 473 nm (Shanghai Laser and Optics Century BL473-100FC) 10 minutos después del primer lametón durante cada día de entrenamiento. Inmediatamente antes de encender el láser, se eliminó el acceso a la solución, de modo que el silenciamiento no se superpusiera con el consumo. Se midió que la potencia del láser era de ~1 a 2 mW en la punta del cable de conexión y se entregó de forma continua durante el resto de la hora experimental.

Los ratones recibieron una inyección intraperitoneal (1,2 ml de agua o 0,12 ml de NaCl 3 M). Se recolectó sangre (250 μl) en tubos capilares recubiertos con EDTA (RAM Scientific 07-6011) de la mejilla derecha 5 min antes de la inyección y de la mejilla izquierda en un momento específico después de la inyección (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min o 30 min). El proceso de recolección de sangre tomó en promedio 30 s por ratón (las muestras se descartaron si la recolección tomó más de 2 minutos). La sangre se centrifugó (1.000 g durante 30 min), y el sobrenadante se retiró y se centrifugó nuevamente (10.000 g durante 30 min) para aislar el plasma. La calidad del plasma se clasificó según el color y las muestras se descartaron con una luminosidad inferior al 70 % (consulte el color #ff6666 como referencia). La osmolalidad del plasma se midió inmediatamente por duplicado para cada muestra utilizando un osmómetro de punto de congelación (Fiske Associates 210). Para el análisis se utilizó la diferencia entre las osmolalidades de las dos muestras. A los ratones se les permitió una semana de recuperación entre muestras.

Los ratones se perfundieron transcardiacamente con PBS seguido de formalina al 10%. Se diseccionaron cerebros completos y se mantuvieron en formalina al 10 % durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, los cerebros se transfirieron a sacarosa al 30 % para la crioprotección durante la noche a 4 °C. Se prepararon secciones (40 μm) con un criostato. Para visualizar el etiquetado fluorescente, estas secciones se montaron con DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech) y luego se tomaron imágenes con el microscopio confocal sin tinción. Las imágenes se sometieron a un procesamiento mínimo con ImageJ (v.1.53e).

Analizamos datos de comportamiento, datos de fotometría de fibra y datos de imágenes de microendoscopio utilizando scripts personalizados de MATLAB (v.R2020b, http://www.mathworks.com/products/matlab).

Para el análisis de imágenes de microendoscopio, todas las respuestas se normalizaron usando la función z = (Craw − μ)/σ, donde Craw es una salida de la canalización CNMF-E, μ es Craw medio durante el período de referencia (primeros 10 min) y σ es la desviación estándar de Craw durante ese mismo período de referencia. Para el análisis del potencial de acción, se utilizó la tasa de pico inferida (S; salida de la tubería CNMF-E). Para el análisis de fluorescencia de línea de base, Craw se sometió a un filtro de paso bajo de 1/60 Hz (que elimina todos los cambios que ocurren más rápido que 1 minuto).

Para el análisis de fotometría, todas las respuestas se normalizaron usando la función: ΔF/F0 = (F − F0)/F0, donde F es la señal de fotometría sin procesar y F0 es la fluorescencia predicha usando la señal obtenida con excitación de 405 nm (usando una regresión lineal modelo de ambas señales durante el período de referencia de 10 minutos, datos extendidos Fig. 7a-c). Para la presentación de datos, las trazas graficadas también se redujeron a 1 Hz (esto se hizo para disminuir el tamaño de cada gráfico).

Para la cuantificación de la actividad en diferentes escalas de tiempo de ingestión, se definieron ciertas épocas para las etapas de ingestión oral, gastrointestinal y sistémica. Estas épocas se actualizaron después de analizar los tiempos de subida de cada respuesta en los registros iniciales. Las neuronas se consideraron activadas durante estas épocas, si su cambio medio de actividad durante la época excedía +1z (y, en el caso de los datos extendidos, Fig. 3c, era mayor que el cambio medio de actividad durante otras épocas).

Las respuestas orales (lamer) se definieron para las grabaciones del microendoscopio como el cambio promedio de actividad con puntaje z en los 30 s posteriores al comienzo del primer episodio de lamido. Para las grabaciones GRAB-DA, las respuestas de lamer (orales) se definieron como el cambio promedio de fluorescencia ΔF/F0 en los 30 s siguientes al inicio de la primera serie de lamidas. A lo largo del documento, un episodio de bebida se define como cualquier conjunto de lameduras que duran diez o más segundos en los que ningún intervalo entre lameduras es superior a dos segundos. Para el entrenamiento de preferencia de fluidos, todos los episodios de lamedura para un solo ratón se promediaron y se trataron como una sola réplica.

Las respuestas gastrointestinales se definieron como los cambios promedio de actividad que ocurren en los 12 minutos posteriores al inicio de la infusión intragástrica (según la duración de la mayoría de las infusiones en este documento, así como el tiempo de aumento de la respuesta sistémica).

Las respuestas sistémicas (absorción) se definieron inicialmente (Fig. 1) como cambios promedio de actividad que ocurrieron después de que se eliminó el acceso a la solución o se terminó la infusión intragástrica y la inyección intraperitoneal. Con base en el análisis subsiguiente del tiempo de subida (10–14 después del inicio de la bebida y la infusión intragástrica), y para asegurar que las respuestas sistémicas fueran distintas de aquellas durante la fase gastrointestinal, las respuestas sistémicas (absorción) se redefinieron como cambios promedio de actividad que ocurren 12– 32 min después del inicio de la infusión intragástrica o el primer lametón para registros microendoscópicos (o 12-50 min después del inicio de la infusión intragástrica o el primer lametón para registros fotométricos). Tanto en la fotometría como en los registros microendoscópicos, las respuestas sistémicas se definieron entre 0 y 30 minutos después de la inyección intraperitoneal. El tiempo de subida se calculó como el tiempo que tarda una neurona activada o inhibida en alcanzar el 50 % de su cambio máximo de actividad en un ajuste sigmoidal. Una neurona se consideró inhibida durante una época particular si el cambio promedio de actividad fue más negativo que -1z, y activada si el cambio promedio de actividad fue más positivo que +1z.

La aceleración de la cabeza se definió como la suma rectificada de la aceleración en todos los ejes del acelerómetro colocado en la cámara nVista/nVoke (ver 'Grabaciones del microendoscopio'). Esta señal sumada se filtró a 5 Hz con un filtro Butterworth de fase cero de tercer orden (para eliminar transitorios). Se utilizó la aceleración por debajo de un umbral (definido por el método de Otsu) para distinguir el movimiento del reposo.

A lo largo de este Artículo, los valores generalmente se informan como media ± sem (barras de error o área sombreada). En figuras con regresiones lineales simples, las áreas sombreadas representan el intervalo de confianza del 95% para la línea de mejor ajuste. A excepción de las regresiones lineales, las pruebas no paramétricas se utilizaron de manera uniforme. Los valores de p para las comparaciones pareadas y no pareadas se calcularon mediante pruebas de permutación bilateral (10 000 iteraciones o exactas cuando fue posible). Los valores de p para las comparaciones entre múltiples grupos se evaluaron inicialmente mediante ANOVA, pero se informaron como valores de pruebas de permutación de dos caras. Ocasionalmente, se realizaron pruebas de permutación de un lado cuando claramente se esperaba un resultado particular de los experimentos realizados anteriormente en el artículo (se usaron pruebas de un lado para la Fig. 5e y la Fig. 9b de datos extendidos, y en la Fig. 4 y la Fig. de datos extendidos). . 8). Para los resultados principales de la Fig. 1, se calcularon las correlaciones intraclase71 (= varianza entre ratones/varianza total) y los efectos del modelo mixto lineal (Tabla 1 de datos ampliados) para garantizar que los efectos no se debieron a valores atípicos que se originaron en un ratón. Se utilizaron cálculos de potencia para predeterminar el tamaño de la muestra cuando era posible predecir el tamaño del efecto en base a experimentos anteriores (por ejemplo, se utilizó un cálculo de potencia para la figura 5e pero no para la figura 5b). Los experimentos no fueron aleatorios. Los investigadores desconocían la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados durante los dos experimentos de silenciamiento VTA-DA.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este documento.

Los datos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Los enlaces al código utilizado para el análisis de datos se proporcionan en los métodos.

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Agradecemos a Y. Chen, C. Zimmerman, A. Mamaligas y miembros del laboratorio Knight por sus comentarios sobre el manuscrito, y a C. Zimmerman por el material gráfico. Este trabajo fue respaldado por R01-DK106399 (ZAK), RF1-NS116626 (ZAK, ACK y JDB) y F31-NS120468 (JCRG). ZAK es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

Departamento de Fisiología, Universidad de California, San Francisco, San Francisco, CA, EE. UU.

James CR Grove, Anatol C. Kreitzer y Zachary A. Knight

Instituto Kavli de Neurociencia Fundamental, Universidad de California, San Francisco, San Francisco, CA, EE. UU.

James CR Grove y Zachary A. Knight

Programa de posgrado en neurociencia, Universidad de California, San Francisco, San Francisco, CA, EE. UU.

James CR Grove, Joshua D. Berke, Anatol C. Kreitzer y Zachary A. Knight

Instituto Médico Howard Hughes, San Francisco, CA, EE. UU.

Lindsay A. Gray, Naymalis La Santa Medina, Nilla Sivakumar, Jamie S. Ahn, Timothy V. Corpuz & Zachary A. Knight

Departamento de Neurología, Universidad de California, San Francisco, San Francisco, CA, EE. UU.

Joshua D. Berke y Anatol C. Kreitzer

Instituto Weill de Neurociencias, Universidad de California, San Francisco, San Francisco, CA, EE. UU.

Joshua D. Berke, Anatol C. Kreitzer y Zachary A. Knight

Institutos Gladstone, San Francisco, CA, EE. UU.

Anatole C. Kreitzer

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JCRG y ZAK diseñaron experimentos y analizaron e interpretaron datos. JCRG dirigió y realizó todos los experimentos. JCRG, LAG, NLSM y JSA realizaron cirugías intragástricas. JCRG y NS realizaron experimentos optogenéticos. JCRG y TVC realizaron experimentos de fotometría. JCRG y ZAK escribieron el manuscrito con aportes de ACK y JDB

Correspondencia a Zachary A. Knight.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Paul Kenny y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Grabación de imágenes separadas por una hora con límites de celda generados por CNMFe en ratones no sujetos a manipulación. b, Dinámica de las neuronas VTA-DA durante un episodio de lamer agua y la puntuación z ponderada de la población de las neuronas activadas (rojo) o inhibidas (azul) de 0 a 30 s después del inicio del primer episodio de lamido. c, Rastros de actividad de neuronas individuales durante y después del consumo de agua (ver Fig. 1c para ejemplos adicionales). d, Puntuación z media de las neuronas activadas después de beber agua e ilustración de cómo se calcula el tiempo de aumento del 50 % (T50) para las neuronas que responden a la infusión de agua IG. Se muestra el tiempo de acceso al agua ("lameduras de agua"). e, Tasa media de pico inferido de neuronas DA activadas después de la ingestión de agua. f, g Cambios en la tasa de picos inferidos (f) y la fluorescencia de referencia (g; ver Métodos) en las neuronas DA activadas después de la ingestión de agua. h, Porcentaje de neuronas activadas e inhibidas después de la ingestión de agua para cuatro ratones de la Fig. 1d. i, Diagramas de caja de resumen que muestran el cambio de actividad con puntaje z después de la ingestión de agua para cada neurona en cada uno de los cuatro ratones (correlación intraclase o ICC = varentre ratones/vartotal). j, Lamidas acumulativas para beber agua o solución salina hipertónica (0,3 M NaCl) a su propio ritmo para ratones sedientos (n = 4 y 3). k, (Izquierda) Respuestas de neuronas individuales durante y después del consumo de solución salina hipertónica (0,3 M NaCl). (Derecha) Actividad media con puntuación z de las neuronas activadas (rojas), inhibidas (azules) y no afectadas (grises) después de la ingestión de solución salina. l, Actividad media con puntuación z durante la infusión de agua IG (de la Fig. 1c) utilizando diferentes umbrales de puntuación z para definir la población activada e inhibida. m, Diagramas de caja de resumen que muestran el cambio de actividad con puntaje z después de la infusión de agua IG para cada neurona separada por ratón (los datos provienen de todos los registros durante la infusión de agua IG en ratones deshidratados; cada réplica es un ratón diferente; de ​​la Fig. 1 y Figs de datos extendidos . dieciséis). n, los puntos de datos son el cambio medio en la actividad con puntuación z (para todas las neuronas) para cada ratón que se muestra en el panel m. El gráfico de barras muestra la media de estas puntuaciones z medias. o, Actividad media de las neuronas activadas después de la infusión IG de agua a velocidades de 0,1 ml/min (lenta) y 0,2 ml/min (rápida) y un gráfico resumen del T50. p, Aceleración media de la cabeza durante y después de la infusión de agua IG (n = 3 ratones). q, Respuestas medias de neuronas activadas e inhibidas (puntuación z ponderada por población) después de la infusión de IG de diferentes volúmenes de agua en ratones saciados y privados de agua. r, Respuestas medias de neuronas activadas e inhibidas (puntuación z ponderada por población) después de inyecciones IP de 0,12 ml de NaCl 3 M, NaCl 1 M y manitol 2 M. Tenga en cuenta que el NaCl 1 M y el manitol 2 M son equiosmóticos. s, respuesta media de las neuronas inhibidas por la inyección de NaCl en la vena de la cola (la ampliación muestra una escala de tiempo más corta para ilustrar la respuesta rápida). t, respuestas medias y proporción de neuronas activadas e inhibidas después de la inyección en la vena de la cola (asteriscos de la prueba de permutación aplicada a todas las neuronas). u, Dinámica de neuronas individuales activadas durante la infusión de agua IG (1,2 ml). u, Dinámica de neuronas individuales activadas durante la infusión de agua IG (1,2 ml). v, Toallitas para los ojos provocadas dentro de los 15 s de la administración ocular de capsaicina al 0,1%. Esto se realizó tres días después de la inyección IP de 50 mg/kg de capsaicina o solución salina de control para validar funcionalmente la desaferenciación de capsaicina. w, respuestas medias y proporción de neuronas activadas e inhibidas después de la infusión de agua IG (1,2 ml) en ratones deshidratados antes y después de la desaferenciación vagal con 50 mg/kg de capsaicina. ns.P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Todas las barras de error muestran las estadísticas de la media ± sem en la Tabla 2 de datos ampliados.

a, las respuestas de las neuronas VTA-DA a la infusión de agua IG (de la Fig. 1d) exhiben instancias de actividad coordinada aparente cuando se ven en una escala de tiempo de decenas de minutos. Los puntos de aparente actividad coordinada están marcados con flechas. b, La vista de primer plano de las primeras 100 neuronas muestra que no todas las neuronas participan en esta actividad coordinada. c, La dinámica más ampliada de las primeras 100 neuronas muestra que gran parte de esta actividad no está coordinada en la escala de tiempo de los segundos.

a, Respuesta media de las neuronas VTA-DA durante una serie de lamidas de Guarantee. b, Actividad neuronal media durante el consumo de agua y de Asegurar, representada como el trazo medio y el diagrama de resumen. La "respuesta a lamer" se define como el cambio medio de actividad con puntuación z de 0 a 30 s después del inicio del consumo. La "respuesta retardada" se define como el cambio medio de actividad con puntuación z de 0 a 20 min después del final del consumo. c, Respuestas de neuronas VTA-DA individuales durante y después de la infusión IG de Guarantee y agua (1,2 ml). Las neuronas se separan según se activen con más fuerza durante o después de la infusión de IG. d, Respuestas medias de las neuronas activadas e inhibidas durante y después de la infusión de IG (puntuación z ponderada de la población, como se define en la Fig. 1). e, Tiempo de subida de las neuronas activadas (de Datos extendidos Fig. 2c). ns.P > 0,05, ***P < 0,001, por prueba de permutación. Todas las barras de error y las líneas sombreadas muestran la media ± sem

a, mapas de sintonización que muestran las respuestas de las neuronas DA individuales durante el consumo de agua y después de la ingestión. b, Proporción de neuronas activadas durante el consumo de agua y post-ingesta y correlación de actividad. c, Proporción de neuronas activadas durante el consumo de agua y durante la infusión IG de agua y correlación de actividad. d, Proporción de neuronas activadas después de la ingestión de agua y durante la infusión de agua IG y correlación de actividad. e, Ejemplo de rastros de neuronas que se activan tanto después de la infusión de agua IG como después del consumo de agua a su propio ritmo, junto con la proporción de neuronas activadas por ambos y la correlación de la actividad. f, Proporción de neuronas activadas después de la infusión de Guarantee IG y después de la inyección IP de glucosa y correlación de actividad. g, Proporción de neuronas inhibidas después de la infusión IG y la inyección IP de NaCl y correlación de actividad. h, Respuestas de neuronas individuales durante la infusión de IG de Guarantee y glucosa, junto con la correlación de la actividad de las neuronas rastreadas. Estadísticas en la Tabla de Datos Extendidos 2.

a, (Izquierda) Imagen representativa de la colocación de lentes GRIN para obtener imágenes de las neuronas LH. Barra de escala, 0,5 mm. (Derecha) Actividad con puntuación z ponderada por población y proporciones de neuronas LH-GABA activadas (rojas), inhibidas (azules) y no afectadas (grises) después de la infusión de IG (1,2 ml) de agua (388 neuronas/3 ratones) y (169 neuronas/3 ratones). b, Tiempo de subida de las neuronas LH-GABA (de a) y VTA-DA (de las Figs. 1e, 2b-c) activadas después de la infusión IG de asegurar o agua (1,2 ml). c, Dinámica de neuronas LH-GABA individuales después de la inyección IP de solución salina hipertónica (NaCl 3 M, 0,12 ml; 5 ratones). d, (Izquierda) Esquema de imágenes de microendoscopio de neuronas LH-GABA→VTA. (Derecha) Gráfico dividido y proporción de neuronas de proyección activadas, inhibidas y no afectadas después de la infusión de agua (160 neuronas/3 ratones) y Guarantee (150 neuronas/3 ratones). e, Esquema para imágenes de microendoscopio simultáneas de neuronas VTA-GABA y estimulación optogenética de terminales de neuronas LH-GABA, junto con la dinámica de neuronas individuales de VTA-GABA durante la estimulación de terminales de neuronas LH-GABA (3 ratones). Todas las líneas sombreadas muestran la media ± sem

a, (Izquierda) Esquema para imágenes de microendoscopio simultáneas de neuronas VTA-DA y activación optogenética de neuronas SFO "sed". (Medio) Efecto de la activación de la neurona SFO en la ingesta de agua (5 min en ratones saciados; n = 3 ratones). (Derecha) Resumen de gráficos de barras y porcentajes de neuronas VTA-DA activadas (rojas) o inhibidas (azules) por inyección IP de solución salina o CNO. b, Respuestas medias y proporción de neuronas activadas e inhibidas durante la infusión de agua IG (1,2 ml) después de la activación de la neurona SFO, la privación de agua o ninguna. c, (Izquierda) Esquema para imágenes de microendoscopio simultáneas de neuronas VTA-DA y activación optogenética de neuronas "hambre" AgRP. (Medio) Efecto de la activación de las neuronas AgRP en la ingesta de alimentos (5 min en ratones saciados; n = 3 ratones). (Derecha) Respuestas medias y proporción de neuronas activadas e inhibidas después de la activación o el control de las neuronas AgRP. d, (Izquierda) Dinámica de neuronas individuales. (Derecha) Respuestas medias y proporción de neuronas activadas e inhibidas después de la infusión de IG de Guarantee (0,6 ml) después de la activación de las neuronas AgRP, la privación de alimentos o ninguna. Tenga en cuenta que tanto la privación de alimentos como la estimulación de neuronas AgRP reducen de manera contradictoria las respuestas de DA a los nutrientes de IG. e, Respuestas medias y proporción de neuronas activadas e inhibidas después de la inyección intraperitoneal (IP) de glucosa al 50 % (0,3 ml) después de la activación de las neuronas AgRP, la privación de alimentos o ninguna. f, Respuestas medias y proporción de neuronas activadas e inhibidas durante la infusión de IG de Guarantee (0,6 ml) después de la activación de las neuronas AgRP, la privación de alimentos o ninguna. g, (Izquierda) Esquema para imágenes de microendoscopio simultáneas de neuronas LH-GABA → VTA y activación quimiogenética (hM3Dq) de neuronas SFO "sedientas". (Centro) Gráficos de barras de resumen y porcentajes de neuronas LH-GABA→VTA activadas (rojo) o inhibidas (azul) por solución salina o CNO. (Derecha) Gráficos de barras de resumen y porcentajes de neuronas LH-GABA→VTA activadas (rojas) o inhibidas (azules) después de la infusión de agua IG (1,2 ml). hola, Respuestas a alimentos y agua en un estado de necesidad ortogonal. h, respuestas medias y proporción de neuronas VTA-DA activadas e inhibidas después de la infusión de agua IG (1,2 ml) mientras estaba saciado o privado de alimentos. i, Respuestas medias y proporción de neuronas VTA-DA activadas e inhibidas después de la infusión de Guarantee IG (1,2 ml) mientras estaba saciado o deshidratado. j, Respuestas medias y proporción de neuronas VTA-DA activadas e inhibidas después de la infusión IG de solución salina hipertónica (NaCl 0,3 M, 1,2 ml) en ratones que están saciados o con agotamiento de sodio. ns.P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Todas las barras de error muestran las estadísticas de la media ± sem en la Tabla 2 de datos ampliados.

a, Respuestas de fluorescencia GRAB-DA medias en BLA durante y después de la infusión IG de Guarantee o la infusión simulada usando longitudes de onda de excitación de 405 nm y 470 nm. Tenga en cuenta la escala de tiempo de la grabación. b, respuestas GRAB-DA medias a una excitación de 470 nm cuando se normaliza a la respuesta "isosbéstica" de 405 nm. c, respuestas GRAB-DA medias a una excitación de 470 nm cuando se normaliza mediante un ajuste exponencial al decaimiento de la fluorescencia en el período de referencia. Estadísticas en la Tabla de Datos Extendidos 3.

a, Ubicaciones aproximadas (puntos) de fibras de fotometría para grabaciones GRAB-DA, junto con imágenes representativas. Barra de escala, 1 mm. b, respuestas de fluorescencia GRAB-DA en VTA y DS a cambios de hidratación sistémica después de la infusión IG (1,2 ml) de agua o solución salina hipertónica (0,3 M NaCl). c, Respuestas GRAB-DA en VTA y DS después de la infusión IG (1,2 ml) de agua y Asegúrese durante el estado de saciedad y después de la privación de alimentos o agua. d, Respuestas GRAB-DA medias en VTA durante y después de la inyección IP de agua. e, Dinámica de las neuronas de proyección BLA y NAc durante y después de la infusión de agua IG (ver Fig. 4e). f, respuestas GRAB-DA medias durante la bebida a su propio ritmo (filas superior e inferior) y la infusión IG (1,2 ml, fila central) de agua (azul), NaCl 300 mM (gris) y Guarantee (naranja). ns.P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Todas las barras de error y las líneas sombreadas muestran las estadísticas de la media ± sem en la Tabla de datos ampliados 2, 3.

a, Gráficos de resumen del consumo de cada solución en cada día de entrenamiento de preferencia de fluidos utilizando el protocolo en el que los ratones tienen acceso al agua durante 60 minutos en cada día de entrenamiento (ver Fig. 5c). b, la iluminación de las neuronas VTA-DA durante toda la sesión de entrenamiento (60 min) evita el aprendizaje de preferencias en ratones que expresan GtACR pero no en los controles que expresan mCherry. c, (Izquierda) Protocolo de entrenamiento revisado en el que se retira el acceso al agua después de 10 min de consumo en cada sesión de entrenamiento. (Derecha) Se produce un aprendizaje robusto de preferencias incluso con solo 10 minutos de acceso (es decir, se elimina el agua antes de que la actividad VTA-DA haya cambiado debido a cambios posteriores a la absorción; n = 6). d, Cambios en el consumo total en el primer y último día de entrenamiento en el experimento de silenciamiento retardado (Fig. 5e). ns.P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01. Todas las barras de error y las líneas sombreadas muestran las estadísticas de la media ± sem en la tabla 4 de datos ampliados.

a, fluorescencia GRAB-DA en mSh y BLA durante el consumo de la solución hidratante en el primer y último día de entrenamiento (ver Fig. 5e). b, Gráficos de resumen de las respuestas GRAB-DA activadas por lamer en los primeros días de entrenamiento con cada solución. ns.P > 0,05. Todas las barras de error y las líneas sombreadas muestran las estadísticas de la media ± sem en la tabla 3 de datos ampliados.

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Reimpresiones y permisos

Grove, JCR, Gray, LA, La Santa Medina, N. et al. Subsistemas de dopamina que rastrean estados internos. Naturaleza 608, 374–380 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04954-0

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Recibido: 30 de marzo de 2021

Aceptado: 08 junio 2022

Publicado: 13 julio 2022

Fecha de emisión: 11 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-04954-0

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