Procesamiento subcortical conservado en visuo | Grupo de latiguillos de Jilin

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4699 (2022) Citar este artículo

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La estabilización de la mirada compensa los movimientos de la cabeza o del entorno externo para minimizar la borrosidad de la imagen. La información multisensorial estabiliza la escena en la retina a través de los reflejos vestíbulo-ocular (VOR) y optocinético (OKR). Si bien la organización de los circuitos neuronales subyacentes al VOR está bien descrita en todos los vertebrados, se sabe menos sobre la contribución y evolución del OKR y las estructuras básicas que permiten la integración viso-vestibular. Para analizar estas vías neuronales que subyacen a la integración viso-vestibular, desarrollamos una configuración utilizando una preparación ojo-cerebro-laberinto de lamprea, que permitió coordinar registros electrofisiológicos, estimulación vestibular con una plataforma móvil y estimulación visual a través de pantallas. Las lampreas exhiben una sólida integración viso-vestibular, con información optocinética procesada en el pretectum que puede regularse a la baja desde el tectum. Las entradas visuales y vestibulares están integradas en varios niveles subcorticales. Además, los movimientos sacádicos están presentes en forma de nistagmo. Por lo tanto, todos los componentes básicos del control viso-vestibular de la mirada ya estaban presentes en los albores de la evolución de los vertebrados.

La aparición de ojos formadores de imágenes permitió a los animales usar la visión para repertorios de comportamiento avanzados que requerían mecanismos para estabilizar el mundo en la retina para evitar la degradación de la imagen1. En los vertebrados, la estabilización visual se logra a través de dos reflejos que se cree que han evolucionado en paralelo1,2. Los movimientos de la cabeza provocan cambios compensatorios de los ojos mediados por señales vestibulares a través del reflejo vestíbulo-ocular (VOR). En el reflejo optocinético (OKR), el flujo óptico retiniano se retroalimenta a los músculos del ojo, generando movimientos compensatorios para estabilizar la imagen. Las entradas somatosensoriales complementarias también contribuyen a la estabilización de la imagen3,4. Además, las descargas corolarias permiten que el cerebro distinga los movimientos de cabeza pasivos de los generados activamente5. El VOR y el OKR actúan juntos para compensar la perturbación generada por los movimientos de la cabeza y contribuyen a un control sólido del movimiento ocular. A medida que aumenta la velocidad del movimiento de la cabeza, la contribución vestibular se vuelve dominante6,7.

A pesar del impacto que tiene el movimiento visual en la estabilización de la mirada, la contribución de este sistema ha sido la menos estudiada en comparación con el sistema vestibular. El sustrato neuronal de OKR se encuentra en el área pretectal/sistema óptico accesorio en los vertebrados estudiados8,9, pero los mecanismos neuronales por los cuales el movimiento visual de gran campo genera el OKR y su origen evolutivo son poco conocidos. El VOR, por otro lado, apareció muy temprano en la evolución de los vertebrados y, aunque pueden existir diferentes configuraciones específicas de especies, el circuito sináptico que convierte la información vestibular en el movimiento ocular compensatorio apropiado está presente en todos los vertebrados10.

La estabilización de la mirada representa un comando motor primordial; sin embargo, pocos estudios han abordado la contribución resultante de las interacciones VOR y OKR. La integración viso-vestibular se ha analizado principalmente a nivel de la corteza y el cerebelo11, en lugar de centrarse en el procesamiento subcortical fundamental para el VOR/OKR. Aquí analizamos la estabilización de los movimientos oculares en la lamprea, el vertebrado existente más antiguo, y las vías neuronales responsables de la integración multisensorial. Aunque con pequeñas diferencias en la organización de la retina en comparación con los gnatóstomos12, las lampreas tienen ojos de cámara que forman imágenes bien desarrollados, y la organización de los músculos oculares y los núcleos motores es notablemente similar a la de otros vertebrados1,13,14,15. Presentan VOR16 y un sistema vestibular bien desarrollado, presentando un laberinto con dos canales semicirculares (anterior y posterior) considerados homólogos a sus contrapartes gnatóstomas, mientras que carecen de un canal horizontal lateral17,18,19. Sin embargo, las lampreas tienen un sistema de conductos horizontales que proporciona información vestibular también en el plano de guiñada, que parece haber evolucionado en paralelo al canal horizontal del gnatóstomo17,18,19. Por lo tanto, el laberinto de la lamprea es capaz de generar movimientos oculares y corporales compensatorios en el plano de guiñada utilizando la misma arquitectura del circuito cerebral responsable de las rotaciones de balanceo y cabeceo20. Aún no está claro si las lampreas tienen movimientos oculares optocinéticos. El hecho de que tengan representación retinotópica tanto en el tectum como en la corteza visual, y un control preciso de los movimientos oculares desde el tectum sugiere que la visión puede contribuir a la estabilización de la mirada21,22,23,24,25,26.

Además del movimiento ocular lento compensatorio, las respuestas VOR/OKR presentan latidos de nistagmo, un restablecimiento rápido de la posición del ojo que tiene lugar cuando los ojos alcanzan el límite de su rango dentro de la órbita. Estos movimientos de reinicio rápido se consideran el origen de los movimientos sacádicos y constituyen, junto con el VOR y el OKR, el modelo del que se derivan todos los tipos de movimientos oculares1,27. Aunque los movimientos oculares pueden ser provocados estimulando eléctricamente el techo óptico o el área motora en palio, así como presentando estímulos visuales21,24,28, aún no se sabe si las sacadas están presentes o no.

En este estudio mostramos que el OKR está presente en la lamprea, y que su principal procesamiento visual tiene lugar en el pretectum, que envía información a los núcleos oculomotor y vestibular. Además, el fuerte efecto aditivo entre OKR y VOR informado en mamíferos ya estaba presente en la lamprea, y las señales visuales y vestibulares están integradas en varios niveles subcorticales, lo que indica que la estabilización de la mirada visuo-vestibular no requiere procesamiento cortical o cerebeloso, aunque puede ser regulado a la baja desde tectum. La lamprea también exhibe claros latidos de nistagmo, lo que demuestra que todos los tipos de movimientos oculares estabilizadores ya estaban presentes cuando la lamprea se separó de la línea evolutiva que condujo a los mamíferos.

Para confirmar que las lampreas exhiben VOR16,29, realizamos experimentos de comportamiento, videos que rastrean los movimientos oculares en respuesta a la estimulación vestibular. Los animales intactos se colocaron en un tubo transparente lleno de agua fría (Fig. 1a). Los movimientos oculares se rastrearon utilizando el software DeepLabCut30 (Fig. 1b). La estimulación vestibular dio lugar a movimientos oculares compensatorios prominentes en los tres planos (balanceo, cabeceo y guiñada; N = 9; Fig. 1b-d; Películas complementarias 1-3). Para investigar la ganancia del ojo en relación con el movimiento de la cabeza, se colocó un acelerómetro en el tubo transparente (N = 3). Luego, el tubo se maniobró en los tres planos manualmente a velocidades que oscilaban entre 60 y 200 grados/s mientras se seguía el ojo de la lamprea. Posteriormente, se trazaron las posiciones de los ojos y la cabeza (Fig. 1b-d) y se compararon en términos de su alineación espacial y temporal (Fig. 1a complementaria). La ganancia dinámica se calculó comparando las velocidades ojo-cabeza (ver Métodos). Se encontró que la ganancia era de 0,77 ± 0,19 para balanceo, 0,6 ± 0,23 para cabeceo y 0,69 ± 0,13 para guiñada. La ganancia de posición se recuperó comparando el área bajo la curva (AUC) entre el ojo y la cabeza durante el movimiento activo. Los valores de ganancia fueron 0,67 ± 0,16 para balanceo, 0,45 ± 0,16 para cabeceo y 0,64 ± 0,25 para guiñada.

un esquema que muestra la configuración utilizada para monitorear los movimientos oculares VOR. b–d (Superior) Cuadros representativos antes (izquierda) y en el punto máximo de estimulación (derecha) en respuesta a las rotaciones en los planos de balanceo (a), guiñada (b) y cabeceo (c) (barras de escala = 1 mm) . La línea punteada roja indica la posición del ojo antes de la estimulación y la línea punteada verde su posición en el pico de estimulación vestibular. Los puntos de colores en las imágenes representan las etiquetas utilizadas por el sistema de seguimiento para calcular la trayectoria del ojo. (Abajo) Trazos que representan la posición del ojo (negro) con respecto a la posición de la cabeza durante varias rotaciones en los planos de alabeo (verde), guiñada (rojo) y cabeceo (azul). e–g Ilustraciones esquemáticas de la plataforma basculante de lamprea. El sistema se controla a través de Matlab, lo que permite estimulaciones visuales y vestibulares sincronizadas a través de una placa controladora Arduino, que también involucra un digitalizador para registros electrofisiológicos. La plataforma se mueve con un servomotor, controlado por otra placa Arduino, que hace girar la cámara transparente que contiene la preparación junto con los electrodos de registro. Una cámara transparente (que contiene una preparación ojo-laberinto-cerebro) conectada a una plataforma basculante se coloca entre dos pantallas vistas de frente (e) y lateral (f). Una representación general de la plataforma se muestra en g. h Esquema que muestra la preparación utilizada para registrar la actividad en los músculos oculares o en diferentes áreas del cerebro. Los cuadrados rojos indican la ubicación de las cápsulas óticas, donde se encuentran los órganos vestibulares. A la izquierda se muestra un trazo representativo que muestra la actividad evocada en respuesta a una inclinación de 22,7° de la plataforma con una velocidad angular de 112,94°/s, combinada con estimulación visual coordinada. A la derecha hay registros similares provocados por la estimulación optocinética de 48,71°/s (arriba) y la estimulación vestibular en la oscuridad de la misma velocidad con una amplitud de 5,8° (abajo). El área azul indica la duración del movimiento de balanceo, el amarillo la duración de la inclinación estática y el rectángulo punteado significa estimulación optocinética en curso. Abreviaturas: RR Rostral rectus, DR Dorsal Rectus, CR Caudal rectus, aCSF líquido cefalorraquídeo artificial.

En animales intactos pudimos investigar el comportamiento del VOR, pero no fue posible analizar la contribución de la información visual y vestibular, lo que implicaba largos experimentos, en animales intactos (ver Métodos). Para estudiar la interacción entre las entradas visuales y vestibulares, se desarrolló una configuración que permite estímulos visuales y vestibulares coordinados a través de una plataforma basculante mientras se realizan registros electrofisiológicos en una preparación aislada del cerebro de lamprea y la médula espinal rostral con los ojos y los órganos vestibulares (órganos óticos). cápsulas) (Fig. 1e-g, Película complementaria 4). Los estímulos visuales consistían en barras horizontales que se movían en el eje vertical en direcciones opuestas (es decir, cuando las barras presentadas al ojo derecho se mueven hacia arriba, las del ojo izquierdo se mueven hacia abajo), reflejando entradas visuales durante una rotación corporal. La preparación oculo-vestibular-cerebral se alineó con la plataforma giratoria para producir estimulación vestibular en el plano de balanceo.

Para verificar la viabilidad de la preparación, se adjuntó una cámara de video al frente, que muestra que los movimientos oculares VOR se evocan en respuesta a la estimulación del balanceo (Figura complementaria 1b). Para cuantificar de manera confiable el VOR a lo largo del estudio, realizamos registros EMG del músculo extraocular recto dorsal (DR; Fig. 1h). Este músculo fue constantemente activado por la estimulación del giro hacia abajo, de acuerdo con un movimiento ocular compensatorio en la dirección opuesta a la estimulación vestibular. La Figura 1h (trazo verde) muestra una respuesta representativa a una estimulación visual y vestibular combinada (ver también Película complementaria 5). Se indujeron respuestas confiables mediante optocinética aislada (Fig. 1h, trazo azul) o estimulación vestibular (Fig. 1h, trazo naranja). No se evocó actividad cuando la plataforma volvió a una posición horizontal (Fig. 1h, trazo verde, asterisco rojo), lo que indica que la activación muscular corresponde a un VOR en este plano. Para asegurarnos de que la actividad EMG registrada en los músculos extraoculares correspondiera de manera confiable a los movimientos oculares, realizamos estimulaciones eléctricas a intensidades crecientes en el núcleo octavomotor anterior (AON; uno de los núcleos vestibulares involucrados en VOR, ver más abajo) mientras registramos la actividad EMG en el recto dorsal y simultáneamente graba en video los movimientos oculares (Fig. 1c complementaria; N = 2). La actividad EMG aumentó en paralelo con la amplitud de los movimientos oculares (Figura complementaria 1c-e; Película complementaria 6) y, por lo tanto, puede usarse para medir indirectamente los movimientos oculares.

Con esta plataforma experimental pudimos monitorear los movimientos oculares y registrar la actividad extracelular en diferentes áreas del cerebro en respuesta a una estimulación vestibular y/o visual.

Aunque se ha demostrado que los estímulos visuales (puntos y barras amenazantes presentados en un ojo) evocan movimientos oculares y de orientación/evasivos24,25, no se ha demostrado un OKR en la lamprea. Para probar esto, aplicamos una cuadrícula de barras que se mueven en los tres ejes principales (balanceo, cabeceo y guiñada) a velocidades crecientes, y monitoreamos la actividad EMG en el recto dorsal (para estimulación de balanceo y cabeceo) o el recto caudal (para guiñada). estímulo).

Hubo un aumento significativo en la amplitud y el número de picos de la actividad EMG en respuesta a un aumento de la velocidad de balanceo (n = 18 de seis lampreas). Los gráficos de la Fig. 2a muestran que las respuestas en términos de amplitudes EMG (izquierda) y picos (derecha) aumentan en paralelo con la velocidad de la estimulación (véanse los trazos representativos en la Fig. 2b). En la Fig. 2e se muestran los datos combinados de seis animales. Lo mismo ocurrió con la actividad evocada en el plano de tono (n = 15 de cinco lampreas, Fig. 2f). Tanto las amplitudes de EMG (Fig. 2c, izquierda) como el número de picos (Fig. 2c, derecha; vea los rastros representativos en la Fig. 2d) aumentaron con la velocidad de estimulación. Sorprendentemente, no se encontró ningún efecto significativo para las estimulaciones en el plano de guiñada, al que se someterá la lamprea durante cada ciclo de natación (Fig. 1g, h; N = 10). Aunque se pudieron evocar respuestas visuales, fueron muy poco confiables y no se observó un aumento obvio en paralelo con la velocidad del estímulo visual (Fig. 2g, h). Los mismos animales mostraron OKR confiable tanto en los planos de balanceo como de cabeceo (Fig. 2i, Fig. 2a complementaria, b). Así se establecieron respuestas optocinéticas claras en los planos de cabeceo y balanceo, indicativas de movimientos oculares compensatorios en respuesta a los movimientos visuales de toda la escena.

a Ilustración gráfica de las amplitudes EMG normalizadas (izquierda) y el número de picos (derecha) de la actividad EMG evocada en el recto dorsal de un animal durante las estimulaciones optocinéticas en el plano de balanceo en un rango de velocidades. b Trazas representativas a tres velocidades diferentes durante las estimulaciones de balanceo. El rectángulo punteado indica la duración de la estimulación optocinética. c Gráficos que muestran la actividad EMG en el recto dorsal de un animal durante estimulaciones optocinéticas en el plano de cabeceo en un rango de velocidades. d Rastros representativos a tres velocidades diferentes durante las estimulaciones de tono. e, f Promedio de amplitudes y picos de EMG que reflejan la actividad de EMG en el recto dorsal en respuesta a la estimulación optocinética en los planos de balanceo (e) y cabeceo (f) que combinan los datos de seis animales para balanceo y cinco para cabeceo. Un ANOVA de medidas repetidas reveló efectos significativos de la velocidad de estimulación en las amplitudes EMG (F[3, 51] = 7,858, p < 0,001) y picos (F[3, 51] = 3,366, p = 0,026) en el plano de balanceo, así como como amplitudes EMG (F[4, 56] = 5,057, p = 0,001) en el plano de cabeceo. g Gráfico que muestra que la actividad EMG no aumenta en paralelo a la velocidad de la estimulación optocinética en el plano de guiñada. Los rastros representativos se muestran en h. Sin embargo, se observaron respuestas optocinéticas fiables en el plano de balanceo en animales que carecían de una respuesta en el plano de guiñada. Se realizaron correcciones de Holm para todos los análisis. Las áreas sombreadas en los gráficos indican bandas de error. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. El análisis del plano de balanceo se llevó a cabo en n = 52 muestras independientes de tres animales, mientras que el análisis del plano de cabeceo se llevó a cabo en n = 57 muestras independientes de tres animales.

Dado que tanto las entradas visuales como las vestibulares contribuyen a la estabilización de la mirada, la siguiente pregunta fue cómo una combinación de estas dos modalidades sensoriales impacta en los movimientos oculares compensatorios. Para probar esto, se registró la actividad del recto dorsal en respuesta a la estimulación visual (VIS), vestibular (VES) y visuo-vestibular (VISVES) (Fig. 3a) bajo cuatro parámetros distintos en el plano de balanceo: baja amplitud, baja velocidad ( 5,8°; 48,7°/s; n = 24 de ocho lampreas), baja amplitud—alta velocidad (5,8°; 112,94°/s; n = 37 de 13 lampreas), alta amplitud—baja velocidad (22,7°; 48,7°/ s; n = 24 de ocho lampreas), y alta amplitud-alta velocidad (22,7°; 112,94°/s; n = 29 de diez lampreas). Se presentó una estimulación optocinética continua, para permitir un mejor control sobre las respuestas evocadas y una evaluación holística de la integración viso-vestibular. El análisis tanto de la estimulación viso-vestibular dinámica inicial como de las respuestas posteriores de imponer solo un componente visual dinámico en una señal vestibular estática permitió consideraciones temporales y una perspectiva matizada sobre la estabilidad de la mirada. Como se observaron diferencias en la intensidad de la señal entre animales, las respuestas se normalizaron en cada animal a las intensidades máximas, lo que nos permitió comparar los resultados obtenidos en las diferentes preparaciones y obtener la relación entre las modalidades sensoriales.

a Una representación esquemática de los tres paradigmas experimentales implementados: visual (arriba), vestibular (medio) y visovestibular (abajo). Las flechas indican la dirección del movimiento de los estímulos tanto para la estimulación visual (verde) como para la vestibular (negra). Se colocó un electrodo de registro en el músculo recto dorsal derecho. b–e Gráficos que muestran la actividad EMG en términos de número de picos en respuesta a estimulaciones visuales (VIS), vestibulares (VES) y visuovestibulares (VISVES) durante cuatro protocolos de estimulación diferentes en términos de amplitud y velocidad. La amplitud se refiere al ángulo máximo de inclinación de la plataforma y la velocidad a la velocidad de movimiento de la plataforma o el estímulo visual. La importancia entre las modalidades está representada por estrellas en cada gráfico y se recuperó a través de pruebas T pareadas: Baja amplitud baja velocidad (VES a VISVES t(23) = −4,802, p < 0,001; n = 24 registros de ocho animales), Baja amplitud alta velocidad (VIS a VES t(36) = −3.346, p = 0.002 p = 0.002 y VES a VISVES t(38) = −2.930, p = 0.006 p = 0.006; n = 37 grabaciones de 13 animales), Alta amplitud baja velocidad (VIS a VES t(22) = −11,559, p < 0,001, p < 0,001; n = 24 registros de ocho animales), Alta amplitud alta velocidad (VIS a VES t(27) = −13,808, p < 0,001 ;n = 29 registros de diez animales). f–i Gráficos que muestran la actividad EMG en términos de amplitudes máximas en respuesta a las estimulaciones VIS, VES y VISVES durante cuatro protocolos de estimulación diferentes ((g) VES a VISVES t(38) = −2,475, p = 0,018, n = 37 registros de 13 animales, (h) VIS a VES t(23) = −6,315, p < 0,001, n = 24 registros de ocho animales, VES a VISVES t(22) = −2,614, p = 0,016, y (i) VIS a VES t(28) = −15,457, p < 0,001, n = 29 registros de diez animales). j, k Respuestas representativas para la intensidad más baja (j) y la más alta (k). El área azul indica la duración del movimiento de balanceo, el amarillo la duración de la inclinación estática y el rectángulo punteado rojo significa estimulación optocinética en curso. Todas las pruebas T fueron de dos colas sin correcciones. A lo largo de la figura, los datos se presentan como valores medios ± SD. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Las respuestas individuales de VIS y VES fueron similares, pero cuando se aplicaron juntas, la actividad de VISVES fue mucho mayor, por lo que se reforzaron entre sí (Fig. 3b, f, j). Las pruebas T pareadas revelaron una diferencia significativa en la cantidad de picos evocados entre VES y VISVES (Fig. 3b, j), pero no para la amplitud de EMG (Fig. 3f).

Las respuestas visuales y vestibulares también se potencian entre sí en estas condiciones, como se revela en las diferencias significativas entre VES y VISVES para el número de picos evocados (Fig. 3c, Fig. 3a complementaria), y la amplitud EMG máxima aumentó significativamente entre VES y VISVES. VISTAS (Fig. 3g). El número de picos de VES fue significativamente mayor que el de VIS, lo que indica una mayor contribución de la información sensorial vestibular (Fig. 3c, Fig. 3a complementaria).

La respuesta vestibular fue mucho mayor que la respuesta VIS y la adición de VIS no agregó mucho a la respuesta VISVES al comparar el número de picos (Fig. 3d, Fig. 3b complementaria), pero al considerar la amplitud EMG (Fig. 3h ) VIS se sumó significativamente a VES.

En este caso, la respuesta vestibular dominó y no hubo una adición significativa por la visión en la respuesta combinada de VISVES (Fig. 3e, i, k).

Los resultados anteriores muestran que las estimulaciones visuo-vestibulares conjuntas mejoran las respuestas, pero el impacto visual es más relevante en movimientos de baja amplitud. Esto, junto con el hecho de que las respuestas VIS supraumbral solo se evocan al comienzo de la estimulación visual, sugiere que su papel es más importante al comienzo de los movimientos oculares compensatorios. La visión contribuye al aumentar el número de picos evocados (Fig. 3b-e), mientras que las amplitudes de EMG de la señal integrada se vieron significativamente afectadas solo durante las condiciones de baja amplitud, alta velocidad y alta amplitud, baja velocidad (Fig. 3f-i). Esta diferencia puede tenerse en cuenta al considerar el momento en que se alcanza la amplitud máxima de EMG para cada modalidad sensorial. Para condiciones de baja amplitud, el pico visual apareció más tarde que el vestibular (Fig. 4a-d), y esta desalineación da lugar a un menor impacto de la visión en términos de amplitud de respuesta EMG. Las amplitudes máximas de EMG de VISVES fueron, como se describió anteriormente, más grandes que VES para la mitad de las condiciones (Fig. 3f-i), aunque se desplazaron hacia el momento del pico visual para todas las condiciones (Fig. 4a-d).

a–d Gráficos que muestran el tiempo promedio necesario para alcanzar la amplitud máxima de EMG para cada modalidad durante los diferentes paradigmas. Las pruebas T pareadas arrojaron resultados significativos para: Velocidad baja de amplitud baja (VIS a VES t(16) = 5,506, p < 0,001, n = 17 registros de ocho animales), Velocidad alta de amplitud baja (VIS a VES t(23) = 10,871, p < 0,001, n = 24 registros de once animales y VES a VISVES t(30) = −3,411, p = 0,002, n = 31 registros de once animales), Alta amplitud alta velocidad (VES a VISVES t(28) = 2,818, p = 0,009, n = 29 registros de doce animales). e Mapas de calor que ilustran la actividad de picos durante cuatro paradigmas diferentes para un animal representativo. Los valores se han normalizado al grupo de mayor densidad, y el azul oscuro significa que no hay picos, mientras que el amarillo muestra el mayor número de picos. Cada segmento muestra la actividad de picos en ventanas de 100 ms, combinando los datos promediados de tres ensayos diferentes. Todas las pruebas T fueron de dos colas sin correcciones. A lo largo de la figura, los datos se presentan como valores medios ± DE. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para capturar la dinámica de la contribución visual a lo largo de la extensión de la estimulación, analizamos la cantidad de picos evocados en cada una de las tres condiciones (VIS, VES y VISVES) en ventanas de 100 ms, como se muestra en los mapas de calor de la Fig. 4e. Un efecto claro fue que las respuestas de VISVES se prolongaron en comparación con solo VES (consulte también los rastros en la Fig. 3j, k y la Fig. 3a, b complementaria). Hubo un aumento en el número de picos evocados cuando se compararon los ensayos VISVES con VES incluso antes de la aparición de cualquier actividad evocada solo por estimulación visual. Por lo tanto, VIS evocó un aumento por debajo del umbral en la excitabilidad que pudo potenciar las respuestas vestibulares (consulte también la Fig. 3j, k y la Fig. 3a, b complementaria). Por tanto, aunque los primeros picos visuales aparecen tardíamente en comparación con las respuestas vestibulares (fig. 4a-d), la visión tiene un impacto temprano cuando se combinan ambas modalidades sensoriales, y su contribución prolonga las respuestas evocadas. Los resultados anteriores muestran que las estimulaciones visuo-vestibulares conjuntas mejoran las respuestas, pero el impacto visual es mayor en movimientos de baja amplitud. Este hallazgo, junto con que las respuestas VIS supraumbral se evocan solo al comienzo de la estimulación visual, sugiere que su papel es particularmente importante al comienzo de los movimientos oculares compensatorios.

Nuestros resultados muestran que la interacción entre las entradas visuales y vestibulares determina los movimientos oculares que subyacen a la estabilización de la mirada. Para identificar las diferentes regiones del cerebro que contribuyen a la información visual y/o vestibular para la estabilización de la mirada, analizamos las entradas al núcleo oculomotor (nIII), que inerva el recto dorsal y es el último relé de integración antes del inicio del movimiento de la estimulación vestibular ( las conexiones se resumen en la figura complementaria 4a-h). Algunas de las vías involucradas en VOR se han analizado en larvas de lamprea17,20,31, pero no hay datos disponibles en adultos.

Las inyecciones de neurobiotina en el nIII (N = 4; Fig. 5a-recuadro) mostraron que la población más rostral que se proyecta a este núcleo está en el tálamo ipsilateral (Fig. 5a). También se encontraron algunas neuronas en el tálamo contralateral (no mostrado). Numerosas neuronas fueron marcadas retrógradamente en el pretectum ipsilateral (Fig. 5b), y algunas también contralateralmente. Las inyecciones en pretectum (N = 2) mostraron numerosos terminales en el núcleo oculomotor (no mostrado), lo que confirma las proyecciones pretectales directas a este núcleo. También se observaron proyecciones desde el núcleo del fascículo longitudinal medial (nMLF; Fig. 5c) y el SNc32 (Fig. 5c). No se observaron neuronas marcadas retrógradamente en el techo óptico, lo que sugiere que los movimientos oculares controlados desde esta área21 están mediados por núcleos de relevo (presuntos centros de la mirada), como en otros vertebrados33. Las proyecciones rombencéfalas a la nIII surgen de pequeñas neuronas ubicadas en el área de los núcleos motores troclear (nIV, Fig. 5d) y motor ocular externo (nVI, Fig. 5e)31. El marcaje más conspicuo se encontró en el núcleo octavomotor anterior contralateral, donde se encontraron grandes neuronas marcadas retrógradamente (Fig. 5f; véanse también las referencias 17 y 20). Se pueden observar fibras gruesas que surgen de este núcleo cruzando a diferentes niveles, así como algunas neuronas en el lado ipsolateral (no se muestra). Estos resultados muestran que nIII recibe información del pretectum y del núcleo vestibular, respectivamente.

a Se inyectó neurobiotina en el núcleo oculomotor (recuadro), que mostró proyecciones ipsolaterales del tálamo. b Se encontraron numerosas células marcadas retrógradamente en pretectum formando una población que se proyecta al núcleo oculomotor ipsolateral. c Neuronas retrógradas en la región del nMLF. También se observaron algunas neuronas marcadas retrógradamente en la SNc (flechas). d, e También se encontraron proyecciones de los otros dos núcleos de nervios craneales responsables de la inervación del músculo extraocular, ilustrada aquí por una población celular en el núcleo troclear (d) y el núcleo del músculo ocular externo contralateral (e). También se encontraron neuronas marcadas retrógradamente en la parte ventral de la región ístmica, cerca de los axones gruesos marcados desde el AON. (d flechas). se confirmó una fuerte proyección17,20 del AON, y también se encontraron neuronas marcadas retrógradamente en las caras dorsales del OLA. Abreviaturas: Th Thalamus, Hyp Hypothalamus, pc comisura posterior, PT Pretectum, ot Optic Tract, nMLF Núcleo del fascículo longitudinal medial, SNc, Substantia Nigra Pars Compacta, nIV Núcleo motor troclear, AON Núcleo octavomotor anterior, OLA Área octavolateral, ION Intermedio Núcleo Octavomotor, Núcleo Motor Abducens nVI. Barra de escala = 250 µm en a (y recuadro) y e; 100 µm en b y c; 150 µm en d y f.

Los resultados anatómicos y los datos en otros vertebrados sugirieron que pretectum es el principal contribuyente de información visual a OKR8,9. Sin embargo, tectum juega un papel clave en el procesamiento visual21,22,23,25 y, por lo tanto, intentamos identificar qué región es la principal contribuyente. Complementamos las inyecciones de marcador con la inactivación aguda de estas dos áreas del cerebro para ver el impacto en la actividad del recto dorsal provocada por la estimulación optocinética.

Cuando se inactivó tectum (N = 5), la respuesta OKR permaneció intacta (Fig. 6a, trazo rojo). Por el contrario, las respuestas OKR se abolieron cuando pretectum se inactivó a través de una lesión (N = 3; Fig. 6a trazo azul) o una inyección del antagonista de los receptores de glutamato ácido quinurénico (KA; N = 3; Fig. 6b, trazo rojo, respuestas recuperar después del lavado, rastro verde), incluso cuando el tectum estaba intacto. El gráfico de la Fig. 6c muestra que hay una reducción significativa del OKR después de la inyección de KA en el pretectum (t(6) = 2,633, p = 0,036), y que el OKR se recupera significativamente después del lavado (t(3) = −3,703, p = 0,034).

a Respuestas EMG en el recto dorsal a la estimulación optocinética en un cerebro intacto (trazo negro) y después de la inactivación precisa de la entrada visual a tectum (trazo rojo) y pretectum (trazo azul). b Respuestas EMG en el recto dorsal a un estímulo visual en un cerebro intacto (trazo negro) y después de una inactivación farmacológica precisa con ácido quinurénico de pretectum que condujo a la abolición del reflejo optocinético (trazo rojo), que volvió después de un lavado (trazo verde ). El rectángulo rojo punteado indica la duración de la estimulación visual. c gráfico que muestra la reducción significativa en la actividad del recto dorsal en respuesta a la estimulación optocinética después de la inactivación pretectal con ácido quinurénico (KA; t(6) = 2,633, p = 0,039, n = 7 registros de tres animales), y la recuperación significativa después del lavado (t(3) = −3,703, p = 0,034, n = 4 registros de tres animales). El área sombreada denota bandas de error. d Gráficos que muestran las amplitudes EMG normalizadas (izquierda) y los picos (derecha) de las estimulaciones visuales (VIS), vestibulares (VES) y visuovestibulares (VISVES) en el plano de balanceo después de la inactivación tectal. Las pruebas T pareadas revelaron diferencias significativas en el número de picos evocados entre VIS y VES (t(13) = −3,277, p = 0,006, n = 14 registros de cinco animales) y VES a VISVES (t(14) = −2,740 , p = 0,016, n = 15 registros de 5 animales), así como en amplitudes EMG máximas (VIS a VES t(14) = −3,717, p = 0,002; y VES a VISVES t(14) = −2,917, p = 0,011; n = 15 registros de cinco animales para ambos). e Respuestas del movimiento ocular de la lamprea a las estimulaciones VIS, VES y VISVES en el plano de balanceo durante la inactivación tectal como se refleja en los registros EMG representativos en el recto dorsal. f Las respuestas de VISVES fueron significativamente mayores después de la inactivación tectal para ambas amplitudes (t(14) = −3,005, p = 0,009, n = 15 registros de cinco animales) y picos (t(13) = −2,469, p = 0,028, n = 14 grabaciones de cinco animales). Todas las pruebas T fueron de cola t sin correcciones. Los datos se presentan como valores medios ± SD. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Un homólogo de la corteza visual está presente en el palio de lamprea con la visión representada retinotópicamente26, y la estimulación eléctrica de esta región genera movimientos oculares28. No se observó un impacto significativo en las respuestas visuales evocadas por la estimulación optocinética después de lesionar el área visual, lo que indica que el palio no está directamente involucrado en la generación de OKR (Fig. 4i complementaria; n = 12 de cuatro lampreas).

Luego analizamos los cambios en la integración viso-vestibular después de lesionar el tectum, para ver si la información visual del pretectum todavía tenía un impacto en las respuestas vestibulares. Las respuestas de VISVES aún fueron significativamente más grandes que solo VES (Fig. 6d, e), lo que indica que esta mejora no depende del tectum. En consecuencia, el pretectum parece clave en la transmisión de información visual a las estructuras subcorticales aguas abajo que permiten la integración viso-vestibular para la estabilización de la mirada. Contrariamente a la lesión pretectal, la inactivación del tectum aumentó la actividad del músculo ocular ante estímulos visuales (Fig. 6a, trazo rojo). Esto se manifestó en amplitudes EMG significativamente mayores durante los ensayos VISVES posteriores a la lesión (Fig. 6f), y que este pico se alcanzó antes (reducido de 0,23 ± 0,05 s a 0,19 ± 0,02 s, t [12] = 2,881; p = 0,014 ). En consecuencia, la inactivación tectal mejoró la integración visovestibular, produciendo mayores amplitudes EMG y tiempos de respuesta más cortos.

En otros vertebrados, la visión impacta los núcleos vestibulares independientemente de las proyecciones a los núcleos oculomotores34,35,36. Investigamos si esto también se aplica a la lamprea. El homólogo del núcleo vestibular se divide en núcleo octavomotor anterior (AON), intermedio (ION) y posterior (PON). Las entradas vestibulares al núcleo oculomotor que inerva el recto dorsal provienen del AON y el ION (trabajo actual, 20). Por lo tanto, realizamos grabaciones extracelulares en estos dos núcleos (Fig. 7a; n = 39 de 13 lampreas). En ambos núcleos, la estimulación de la rotación del campo visual provocó respuestas (Fig. 7a; trazo negro). Estas respuestas fueron abolidas por la inactivación de pretectum (n = 9 de tres lampreas; Fig. 5a complementaria), pero no por la de tectum (n = 9 de tres lampreas; Fig. 7a; rastro rojo) y palio (n = 15 de cinco lampreas; no se muestra). Esto indica que solo pretectum proporciona información optocinética a los núcleos vestibulares.

a (izquierda) Registros en el AON en respuesta a la estimulación optocinética durante condiciones normales (trazo negro) y después de una lesión tectal (trazo rojo). El rectángulo rojo punteado indica la duración de la estimulación visual. b Fibras marcadas anterógradamente que terminan en el nIII contralateral, después de una inyección de neurobiotina en AON (recuadro). Las fibras marcadas también discurren más caudalmente hacia la nMLF (óvalo discontinuo; véase e). c Se encontraron células marcadas retrógradamente en el tálamo ipsilateral. d Se pueden ver células marcadas retrógradamente en el pretectum (derecha) con dendritas que alcanzan el tracto óptico. e Terminales en el nMLF ipsilateral. f Proyecciones contralaterales a nivel del lugar de la inyección, que revelan una importante diafonía entre las áreas vestibulares. g Un esquema que muestra la sección gruesa del cerebro de la lamprea utilizada para grabaciones intracelulares de abrazadera de parche, manteniendo el pretectum y exponiendo AON para grabaciones de células completas. Previamente se realizó una inyección de trazador en el tracto del AON al nIII, a nivel del istmo, lo que permitió visualizar las neuronas de proyección en el AON para registros de células completas. h Respuestas excitatorias (abajo, trazo rojo) de una célula representativa en una neurona AON premarcada durante una estimulación de cuatro pulsos (10 Hz). No se observó el cese de los picos, indicativo de entradas inhibitorias, cuando las neuronas se despolarizaron (superior, trazo azul). i Respuestas de voltaje a pasos de corriente de 500 ms hiperpolarizantes y despolarizantes de 10 pA por paso, provocados desde el reposo a −68 mV, que muestran una respuesta umbral (trazo azul) y supraumbral (trazo rojo). j Cuantificación de las amplitudes del potencial postsináptico excitatorio (EPSP) en células AON que se proyectan a nIII evocadas por estimulación sostenida (10 pulsos a 10 Hz) del pretectum/tracto óptico registrado en modo de abrazadera de corriente. Los valores se normalizan al primer EPSP. Los datos se presentan como valores medios ± SD. Abreviaturas: AON Núcleo Octavomotor Anterior, nIII Núcleo Oculomotor, Th Thalamus, pc comisura posterior, PT Pretectum, ot Tracto Óptico, nMLF Núcleo del Fascículo Longitudinal Medial, SNc Substantia Nigra Pars Compacta, OLA Octavolateral Area. Barra de escala = 150 µm en b; 250 µm en el recuadro b; 100 µm en c–f. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego realizamos inyecciones de neurobiotina en AON (N = 4) e ION (N = 4), para mapear el origen de la información visual que llega a estos núcleos vestibulares. Tanto AON como ION reciben las mismas entradas y, por lo tanto, los resultados descritos se aplican a ambos núcleos. Las inyecciones en AON e ION (Fig. 7b, recuadro) confirmaron las proyecciones al núcleo oculomotor (Fig. 7b), y ambas mostraron proyecciones ipsilaterales que terminaban en el nMLF (Fig. 7b, e). La población más rostral dirigida a estos núcleos se encontró en la misma área talámica que envía proyecciones al núcleo oculomotor (Fig. 7c; ver arriba), lo que sugiere que esta región está involucrada en la estabilización de la mirada. No se observaron neuronas retrógradas en el tectum. Sin embargo, se encontró etiquetado en pretectum, como se esperaba en base a los experimentos electrofisiológicos (ver arriba) que corroboran la noción de que la información visual se origina en pretectum (Fig. 7d). Aunque se observaron algunas neuronas en los aspectos mediales del pretectum, la mayoría de las neuronas marcadas retrógradamente se ubicaron cerca del tracto óptico ipsolateral donde se extendían sus dendritas (Fig. 7d). Se observaron numerosas neuronas marcadas retrógradamente en el AON contralateral (e ION para inyecciones en este núcleo), lo que indica que los núcleos vestibulares en ambos lados se influyen entre sí (Fig. 7f).

Para confirmar que la información visual impacta en el vestibular, utilizamos una preparación que expone las neuronas AON para grabaciones de pinzas de parche mientras mantenemos el pretectum (Fig. 7g) y el tracto óptico. Luego, se realizaron inyecciones de dextrano-rodamina en el tracto AON para etiquetar e identificar de forma retrógrada las neuronas AON para grabaciones de pinzamiento (Fig. 7g; n = 8). Las neuronas mostraron respuestas excitatorias a la estimulación pretectal (10 Hz; Fig. 7h, trazo rojo; n = 7), y todos los EPSP evocados tenían amplitudes similares (ligeramente deprimentes; Fig. 7j). No se reveló inhibición cuando las neuronas se mantuvieron en niveles más despolarizados (Fig. 7h, trazo azul). La falta de respuestas inhibitorias se confirmó bloqueando intracelularmente los canales de sodio con QX314 (n = 2) que permitieron la despolarización a -20 mV (Fig. 5b complementaria). Las neuronas que se proyectan al núcleo oculomotor mostraron poca adaptación (Fig. 7i) y poshiperpolarización (Fig. 7i, trazo azul). En conjunto, estos resultados muestran que la integración visovestibular tiene lugar a nivel de los núcleos vestibulares y que la información visual surge en el pretectum. Cuando las neuronas AON no estaban premarcadas, los EPSP se evocaron solo en algunas neuronas en la región del AON (4/23 neuronas registradas) y los IPSP solo en una neurona (no se muestra), lo que sugiere que solo una proporción de las neuronas dentro del AON región interactúa con pretectum.

Como se describió anteriormente, las lampreas poseen un sistema visual bien desarrollado con movimientos oculares que se pueden evocar con estímulos visuales no optocinéticos24. Esto sugiere que pueden ser capaces de realizar movimientos sacádicos orientados a un objetivo y, si es cierto, no solo la fase de reposición lenta sino también la rápida del nistagmo podrían evocarse con estimulación vestibular37. Para analizar el nistagmo, desarrollamos una plataforma que permite una rotación completa de lampreas intactas mientras el video sigue los movimientos oculares (Fig. 8a). Las rotaciones provocaron movimientos oculares compensatorios (VOR), pero también movimientos de reinicio en la dirección opuesta (Fig. 8b-c; Película complementaria 7). Para investigar si el VOR de lamprea presenta movimientos oculares de nistagmo, aplicamos rotaciones de 180° a tres velocidades diferentes (27,4, 68,5 y 137 °/s) y medimos la duración de cada episodio de movimiento ocular (N = 3). De acuerdo con los movimientos nistagmicos, la duración y la velocidad de los movimientos oculares compensatorios lentos cambiaron con la velocidad de rotación (Fig. 8d), mientras que la duración de la fase de reinicio produjo duraciones muy similares (0.024 ± 0.009 s) a través de diferentes velocidades de estimulación en una moda típica de un movimiento ocular nistagmico de fase rápida (Fig. 8d), que muestra que los movimientos de naturaleza sacádica están presentes en la lamprea. El análisis de la dinámica de estos movimientos oculares de reinicio reveló que su velocidad era de 77,06 ± 30,30 grados/s y la amplitud de 1,72 ± 0,73°, sin diferencias significativas al comparar las fases rápidas evocadas a diferentes velocidades de estimulación.

a Nuestra plataforma construida en el laboratorio permitió rotaciones controladas de lampreas intactas en el plano de guiñada. Los animales se encerraron en un tubo de plástico transparente lleno de agua dulce fría. El diámetro del cilindro permitía respirar limitando la libertad de movimiento del animal. Se colocó una cámara en la plataforma para filmar un ojo durante la estimulación, que consistía en rotaciones de 180° a diferentes velocidades. b Las posiciones de los ojos de lamprea se cuantificaron utilizando DeepLabCut, lo que permitió identificar los movimientos de la pupila (se usaron cuatro etiquetas para promediar, indicadas en naranja, azul, morado y rosa) en referencia a la cabeza (amarillo). La línea de puntos roja representa la posición del ojo al comienzo de la estimulación de guiñada (posición estática), mientras que la línea verde indica la posición final de la fase lenta (compensatoria) resultado de un movimiento en dirección opuesta a la de la cabeza. La línea azul indica la posición final del ojo después del siguiente movimiento ocular de fase rápida (reinicio) en la misma dirección que el movimiento de la cabeza. c Usando el rastreador ocular descrito anteriormente, la posición del ojo podría traducirse en grados angulares a lo largo del tiempo, revelando un claro patrón de diente de sierra que indica un VOR con nistagmo. d Las duraciones de las fases lentas (negro) y rápidas (rojo) del movimiento ocular se trazaron para la duración del movimiento de guiñada rotacional. Las duraciones se calcularon en base al análisis cuadro por cuadro de la grabación de video. (27,4, 68,5, 137°/s). Como se indica en el gráfico, los movimientos oculares de fase rápida (rojo) fueron consistentemente de la misma duración general en todas las pruebas en comparación con las fases lentas (negro), que también mostraron una mayor variabilidad entre diferentes pruebas a la misma velocidad, como se refleja en sus desviaciones estándar más grandes en comparación con los movimientos oculares de fase rápida. Los datos se presentan como valores medios ± SD. Las áreas sombreadas indican bandas de error. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La falta de respuestas OKR confiables en el plano de guiñada planteó la cuestión de si otros mecanismos además del VOR compensan los movimientos de la cabeza en este plano. Primero, probamos si la cabeza se estabiliza mientras nada al monitorear animales que se mueven libremente (Película complementaria 8), pero los movimientos de la cabeza acompañaron ondulaciones de natación, lo que indica que la sujeción de la escena visual no se logra con la estabilización de la cabeza. Otra posibilidad establecida en otros vertebrados38,39,40 es que las redes locomotoras a través de una copia de eferencia impulsen movimientos oculares compensatorios en el plano de guiñada. Para probar esto en la lamprea, usamos una preparación semi-intacta21 (Fig. 9a). Primero inmovilizamos la cabeza de la preparación para monitorear si ocurrieron movimientos oculares compensatorios usando una cámara de video colocada en la parte superior para monitorear los movimientos de la cola y los ojos (Fig. 9a). En uno de cada 6 animales, se generaron movimientos oculares coordinados coordinados con la frecuencia de natación (Fig. 9b-f; Película complementaria 9). Aunque reducidos, estos movimientos persistieron cuando se retiraron los laberintos y se seccionaron los nervios ópticos (Fig. 9d, g), lo que indica que surgen de descargas corolarias.

un esquema que muestra la preparación de lamprea semiintacta utilizada para monitorear los movimientos corporales y oculares. El segmento rostral hasta la médula espinal se diseca según los mismos principios que la preparación ex vivo, exponiendo el cerebro y los ojos. El resto del cuerpo y la cola se mantuvieron intactos para permitir la locomoción. Se colocó una cámara de video acoplada a un microscopio para filmar la preparación desde arriba. b Se registró la locomoción espontánea o inducida por el tacto (pellizcando suavemente la cola), y se analizaron los movimientos oculares y corporales a lo largo del tiempo. Se observaron movimientos oculares sincronizados con la actividad de natación. Las imágenes muestran dos posiciones diferentes de los ojos y la cola durante un episodio de natación. c Trayectorias de la cola (negro) y los ojos (verde, ojo derecho; púrpura, ojo izquierdo) que muestran que los movimientos coordinados de ambos ojos ocurren junto con los movimientos de la cola. d Aunque estos movimientos fueron menos consistentes, se conservaron después de la inactivación visual y vestibular. e Gráfico que muestra la correlación positiva (análisis de correlación de Pearson, r (1166) = 0,707, p < 0,001) entre los ojos derecho e izquierdo, indicando su sincronización. f, g Gráficos que muestran que los movimientos de la cola y los ojos están correlacionados antes (f; análisis de correlación de Pearson, r (1160) = −0,553, p < 0,001) y después (g) de la inactivación visovestibular (r (1582) = −0,450, p < 0,001), lo que indica que los movimientos oculares acoplados observados son generados por descargas corolarias de locomoción. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Dado que se observaron claros movimientos oculares compensatorios coordinados con la locomoción, aunque solo en un animal, investigamos si una pequeña activación de los músculos oculares extraoculares que no resultó en movimientos oculares perceptibles podría registrarse a través de EMG. Como se ha demostrado que las descargas corolarias de la natación surgen a nivel de la médula espinal38, realizamos registros EMG en los músculos rectos rostral y caudal (que deben activarse en los movimientos compensatorios del plano de guiñada) mientras registramos simultáneamente en un par de raíces ventrales en la columna vertebral. cable (Fig. 6a complementaria; N = 4). Las grabaciones se llevaron a cabo en una cámara dividida y se aplicó D-glutamato (750 µM) a la médula espinal sin afectar el cerebro (Fig. 6a). D-Glutamato evocó una locomoción ficticia41, como se registró en las raíces ventrales (Fig. 6b complementaria, trazas superiores). Sin embargo, no se evocaron respuestas compensatorias en los músculos oculares (Fig. 6b complementaria, trazas inferiores). En conjunto, estos resultados muestran que las descargas corolarias pueden generar movimientos oculares compensatorios, como se observa claramente solo en un animal, aunque su contribución es en la mayoría de los casos subumbral o ausente, y su origen aún está por determinar.

Nuestros hallazgos muestran que no solo VOR, sino también OKR y movimientos oculares sacádicos en forma de nistagmo están presentes en las lampreas. Usando una plataforma que permite la estimulación visovestibular combinada con registros electrofisiológicos, mostramos que el impacto de la integración visovestibular en los movimientos oculares es similar al de los mamíferos, lo que demuestra que no se requieren influencias corticales ni cerebelosas para la integración multisensorial subyacente a los movimientos oculares mejorados. Mostramos que los movimientos oculares que estabilizan la mirada, incluido el nistagmo, se basan en algunas estructuras subcorticales fundamentales (Fig. 10a).

a Un esquema que muestra el flujo de información visual (desde el ojo) y vestibular (desde el laberinto) cuando se producen movimientos oculares que estabilizan la mirada (sombreado en amarillo) y la vía probable subyacente a los movimientos oculares orientados a un objetivo (sombreado en rojo). Las áreas del cerebro que procesan solo información visual están resaltadas en naranja, vestibulares en azul y visuovestibulares en verde. Tenga en cuenta que, como en los mamíferos, la información visual ya afecta las entradas vestibulares tan pronto como ingresan al cerebro, y que todas las regiones visuovestibulares pueden activarse por entradas visuales o vestibulares de forma independiente. Las motoneuronas de los núcleos oculomotores inician el VOR/OKR reclutando los músculos extraoculares relevantes durante el paso final de la integración sensoriomotora. b Un árbol filogenético que presenta las siete clases principales de vertebrados y los movimientos oculares disponibles para ellos58,66. Tenga en cuenta que este diagrama denota la presencia de un tipo de movimiento ocular dentro de cada clase, lo que significa que no todas las especies miembros necesariamente lo poseen. Los movimientos oculares de seguimiento suave (en rojo) están presentes solo en primates. Las ramas del árbol no están a escala. Abreviaturas: PT pretectum, OT tectum óptico nMLF núcleo del fascículo longitudinal medial, área vestibular VA.

Estudios previos han estipulado que el OKR surgió primero en los condrictios1; nuestros hallazgos empujan el inicio de la estabilización de la mirada guiada visualmente más atrás en un árbol filogenético actualizado de movimientos oculares de vertebrados (Fig. 10b). También mostramos que los movimientos de los ojos compensan claramente la rotación de la cabeza, y que la estabilidad de la mirada provocada por la locomoción está presente como en varias especies de vertebrados. En conjunto, este estudio presenta una serie de puntos de referencia clave para la evolución del control del movimiento ocular y profundiza en sus mecanismos fundamentales.

El VOR en lamprea compensa de manera confiable los movimientos de la cabeza en los tres planos, con amplitudes de movimiento ocular que reflejan las propiedades dinámicas del sistema oculomotor de lamprea, su integración sensoriomotora y la presencia de estabilización de la mirada en los primeros vertebrados. La ganancia dinámica se registró en alrededor de 0,7 mientras que la ganancia de posición se aproximó a 0,6. Estos valores están en gran medida en línea con estudios previos sobre teleósteos42, mientras que se necesitan más ensayos para explorar más a fondo la ganancia VOR de la lamprea. El VOR también se puede observar en preparaciones ex vivo, lo que permite realizar experimentos visovestibulares de forma muy controlada. Aquí confirmamos que el circuito básico subyacente al VOR a través de vías disinápticas ya había evolucionado en las lampreas y luego se mantuvo a lo largo de la evolución de los vertebrados, aunque con modificaciones específicas de la especie10,17,20, y que, además de nIII, la integración visovestibular también tiene lugar en los núcleos vestibulares. y nMLF. Los datos disponibles sugieren que el arco sináptico subyacente al VOR apareció en los primeros vertebrados sostenido por los canales semicirculares anterior y posterior y que se ha mantenido en gran medida en todos los grupos de vertebrados10. La aparición de un canal horizontal lateral en los gnatóstomos, dependiente de Otx17,43, dio lugar a unos arreglos de circuito17. Es decir, se cree que los seis músculos extraoculares exhibidos por la lamprea son homólogos a los de los peces óseos y tetrápodos13,17, pero con algunas diferencias en la inervación de sus núcleos motores en comparación con los gnatóstomos. Tres músculos están inervados por el núcleo oculomotor (nIII), uno está inervado por el núcleo troclear (nIV) y dos por el motor ocular externo (nVI). En los elasmobranquios, cuatro músculos están inervados por el nIII, mientras que uno está inervado por el nIV y otro por el nVI. En peces óseos y tetrápodos, cuatro músculos están inervados por el nIII, uno por el nIV y al menos uno por el nVI17,44. Sin embargo, se mantuvo el mismo esquema computacional, también presente en las lampreas. Curiosamente, las lampreas exhiben un patrón general de proyecciones vestibulares de segundo orden muy similar al de los mamíferos17. El sistema vestibular presenta así elementos muy conservados así como variaciones relacionadas con variaciones funcionales específicas10,45.

Al activar el OKR, nos aseguramos de que la estimulación visual cubriera todo el campo visual, pero notamos que las respuestas desaparecían cuando se aplicaba el mismo estímulo a una distancia mayor, lo que respalda aún más la naturaleza optocinética. El OKR se observó de forma fiable en los planos de balanceo y cabeceo, con un aumento brusco e inmediato tanto en el pico como en la amplitud del EMG a medida que aumentaba la velocidad de la cuadrícula antes de estabilizarse, de acuerdo con el aumento de las velocidades que dificultaba la sujeción visual46. Nuestros experimentos muestran que el OKR depende de la actividad pretectal como en tiburones, peces óseos, anfibios, reptiles, aves y mamíferos9. En consecuencia, como en otros vertebrados47, la inactivación tectal no suprime la OKR.

La clara interconectividad entre los núcleos pretectal, vestibular y oculomotor también respalda la noción de que tanto OKR como VOR tienen orígenes subcorticales, lo que destaca un papel principal de los mecanismos subcorticales, que probablemente se ha mantenido en los mamíferos debido a la preservación filogenética del sistema visual15, 23,25,26. La ausencia de un cerebelo funcional en las lampreas muestra que las vías del cerebelo no son necesarias para el OKR. La información pretectal también llega a los núcleos vestibulares de la lamprea, lo que indica que la vía pretecto-vestibular ya estaba presente en los primeros vertebrados48. Las respuestas de lamprea al movimiento visual de rotación implican una binocularidad pretectal dada la posición lateral de los ojos49, aunque los mecanismos subyacentes del procesamiento visual de campo completo quedan por investigar50.

Sorprendentemente, no se observó OKR en el plano de guiñada, en el que la mayor parte del movimiento se produce en cada ciclo de nado. Sin embargo, aunque nuestros resultados muestran que las descargas corolarias por sí solas en la mayoría de los casos no generan movimientos oculares compensatorios, parecen aportar una contribución subumbral que compensaría la falta de OKR en este plano (fig. 9).

OKR y VOR se potencian entre sí, pero a velocidades más altas aumenta la contribución relativa de la respuesta vestibular. La estimulación vestibular produjo notablemente un movimiento ocular fuerte y duradero como si el ojo estuviera compensando el desplazamiento de la cabeza. Por lo tanto, está claro que la información visual adicional aumenta decididamente la ganancia de movimiento ocular tanto en la lamprea como en los humanos, lo que proporciona más evidencia de que los mecanismos subyacentes se conservan6,7,51. Las entradas visuales del pretectum también potencian las respuestas vestibulares que controlan la postura corporal en las lampreas52,53, lo que sugiere un papel clave del pretectum que contribuye a las respuestas estabilizadoras de la mirada y la postura54.

Las lampreas también muestran nistagmo, que se caracteriza por movimientos oculares balísticos de fase rápida con duraciones fijas en la dirección opuesta a la fase lenta del VOR55. Hasta ahora, se ha considerado que la lamprea no muestra nistagmo16, pero nuestros resultados muestran una fase rápida clara, reiniciando los movimientos oculares como parte del VOR, con duraciones similares independientemente de la velocidad de estimulación o la amplitud del movimiento ocular. Los movimientos oculares que ocurren durante las rotaciones producen fases rápidas y lentas intermitentes que forman el patrón de diente de sierra que caracteriza un VOR típico visto en todo el espectro de vertebrados56,57,58. La velocidad de los movimientos sacádicos en los peces oscila entre cien y algunos cientos de grados por segundo59,60,61. Por lo tanto, los movimientos oculares sacádicos son ligeramente más lentos en las lampreas. En la lamprea, no ha evolucionado un cerebelo funcional y, por lo tanto, el VOR no puede tener el circuito cerebeloso complementario, que en otros vertebrados se utiliza para el ajuste fino del VOR.

Se cree que los movimientos sacádicos dirigidos hacia objetos específicos evolucionaron a partir del nistagmo. Las lampreas poseen un sistema visual bien desarrollado y los movimientos oculares son provocados por estímulos visuales no optocinéticos24. Por lo tanto, es probable que estos animales presenten movimientos sacádicos orientados a objetivos. Nuestros resultados y las grandes similitudes del tectum de la lamprea con el colículo superior de los mamíferos21,22,23,25 indican que el pretectum controla principalmente la estabilización de la mirada/postura54, mientras que el tectum impulsa los movimientos oculares orientados a objetivos (Fig. 10a). Junto con una corteza visual primordial26, es probable que los circuitos principales que controlan los movimientos oculares ya estuvieran presentes antes de que las lampreas se separaran de la línea principal de vertebrados.

En conclusión, hemos identificado el ejemplo vertebrado más antiguo de OKR, que se integra con VOR y produce respuestas de movimiento ocular mejoradas similares a las de los mamíferos. Pretectum es el integrador de primer nivel del movimiento visual, proyectándose posteriormente a los núcleos vestibular y oculomotor como en los mamíferos. Mostramos que la estabilización de la mirada se rige fundamentalmente de manera subcortical, lo que permite interacciones VOR-OKR en ausencia de corteza o cerebelo, así como estabilidad de la mirada apoyada por la locomoción. Al delinear el nistagmo en las lampreas, este estudio revela los orígenes antiguos de los movimientos oculares balísticos orientados a objetivos y muestra que el tectum probablemente regula a la baja los reflejos estabilizadores de la mirada a favor de tales comandos. Todos los movimientos oculares se construyen a partir de dos tipos básicos, lentos y rápidos, ambos mostrados aquí presentes en las lampreas. Por lo tanto, la plantilla neuronal de la que surgieron todos los movimientos oculares ya estaba presente en los albores de la evolución de los vertebrados.

Los experimentos se realizaron en 50 lampreas de río (Lampetra fluviatilis) adultas y 6 lampreas de mar (Petromyzon marinus) adultas jóvenes de ambos sexos. Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité de ética local (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) y la Xunta de Galicia bajo la supervisión del Comité de Uso Animal en Laboratorio de la Universidad de Vigo de acuerdo con la directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y el RD 53/2013 Reglamento español sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos. Los animales se mantuvieron en acuarios con un ambiente enriquecido y agua continuamente aireada y filtrada. Se hizo todo lo posible para minimizar el sufrimiento y reducir el número de animales utilizados.

Para analizar los movimientos oculares compensatorios provocados por la estimulación vestibular (VOR) en animales intactos (N = 9), utilizamos una cámara transparente con una cámara de video unida con un brazo metálico que no interfería en el campo visual del animal (Grasshopper3, GS3-U3-23S6M-C, FLIR Systems, Wilsonville). El diámetro de la cámara era lo suficientemente ancho como para que el animal pudiera respirar normalmente, pero lo suficientemente estrecho como para no permitirle nadar. El tamaño de la cámara se basó en datos de tamaño promedio de varios animales y los utilizados para estos experimentos se eligieron en función de su tamaño para adaptarse a las condiciones descritas anteriormente en esta cámara. El tubo se llenó con agua fría aireada y los animales se anestesiaron levemente con una dosis de metanosulfonato de tricaína (MS-222; 80 mg/L; Sigma-Aldrich) para facilitar su colocación en el tubo y minimizar su estrés. Una vez que el animal se recuperó de la anestesia, se realizaron una serie de estimulaciones vestibulares rápidas en los planos de balanceo, cabeceo y guiñada en la oscuridad mientras se registraban los movimientos oculares evocados por VOR. La duración total de los experimentos fue de 2 a 3 minutos para minimizar el estrés, y luego los animales fueron devueltos a sus acuarios. En algunos de estos experimentos (N = 3) se adjuntó un acelerómetro a la cámara alineada con los órganos vestibulares, de modo que la cinemática de la estimulación vestibular pudiera recuperarse y usarse para calcular la ganancia de la compensación realizada por los ojos de la lamprea. Para ello, se instaló en la plataforma giratoria un acelerómetro ADXL335 (Arduino, Sommerville, MA). Esto nos permitió recuperar la posición exacta de la lamprea en un momento dado, haciendo posible comparar las posiciones de la cabeza y los ojos.

Para realizar un seguimiento de los movimientos oculares, utilizamos DeepLabCut 2.251, un paquete de software de Python que realiza la captura de movimiento en función del aprendizaje de transferencia con redes neuronales profundas, y los datos obtenidos se analizaron mediante scripts Matlab R2020b personalizados. Para analizar los videos, se colocaron las primeras cuatro etiquetas en el ojo grabado en 20 cuadros elegidos al azar de cada video para que las trayectorias inferidas pudieran promediarse para minimizar los errores. También se colocaron etiquetas en el cuerpo para sustraer los pequeños movimientos originados por la respiración y en respuesta a la estimulación vestibular. Luego se entrenó la red, y una vez evaluado el entrenamiento, se analizaron los videos para extraer las trayectorias de las etiquetas y por ende del ojo. Estos datos se usaron para extraer las amplitudes reales de los movimientos oculares, y el diámetro del ojo de la lamprea en los ejes X e Y se midió en milímetros y luego se comparó con la resolución de imagen de las grabaciones de video en píxeles, proporcionando un índice de conversión confiable. Las amplitudes de movimiento de los ojos registradas con la cámara se tradujeron en milímetros. Habiendo establecido el diámetro del ojo de la lamprea, el desplazamiento angular de los movimientos VOR y OKR podría recuperarse en función de funciones trigonométricas.

Colocar a los animales en una cámara transparente generalmente los vio adherir instintivamente la boca a la pared de la cámara, estabilizando su cabeza y permitiéndonos evaluar el VOR y el nistagmo conductualmente. Sin embargo, analizar la contribución relativa de la información visual y vestibular requería aplicar varios paradigmas experimentales y no se podía realizar en animales intactos. Por lo tanto, decidimos utilizar una preparación aislada del cerebro de lamprea y la médula espinal rostral con los ojos y los órganos vestibulares. Esto nos permitió monitorear los movimientos oculares a través de registros EMG de los músculos extraoculares para probar la integración visovestibular, así como registrar e inactivar diferentes regiones del cerebro. Para ello, primero seccionamos la cabeza de los animales profundamente anestesiados con MS-222 (100 mg L−1; Sigma), y luego la sumergimos en una solución de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) enfriada con hielo que contenía lo siguiente (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glucosa y 25 NaHCO3, saturado con 95% (vol/vol) O2/5% CO2. Se eliminó la piel y el cartílago dorsal para exponer el cerebro, y se eliminaron las vísceras y todos los músculos excepto el extraocular para evitar movimientos, manteniendo intactos los ojos y las cápsulas óticas (donde se encuentran los órganos vestibulares). Para garantizar que los movimientos oculares normales se conservaran en la preparación y que los EMG registrados en los músculos extraoculares correspondieran a los movimientos oculares reales, realizamos estimulación eléctrica en el AON a intensidades crecientes, monitoreamos los movimientos oculares y registramos simultáneamente en el recto dorsal (Fig. . 1).

Para permitir registros extracelulares y EMG en respuesta a estímulos visuales y vestibulares coordinados, construimos un dispositivo basculante que permitía la estimulación vestibular de una preparación de ojo-cerebro-laberinto (ver arriba) en el plano de balanceo, colocado entre dos pantallas que permitían la presentación coordinada de estímulos visuales. La plataforma se movió a través de un servomotor y el ángulo y la velocidad se controlaron con una placa de microcontrolador (Arduino Uno). Los estímulos visuales se escribieron en Matlab R2020b usando las extensiones Psychophysics Toolbox Versión 362,63 y otra placa de microcontrolador se subordinó a Matlab para que sus salidas se usaran para coordinar los estímulos visuales, la plataforma basculante y los registros electrofisiológicos. La preparación descrita anteriormente se fijó en una cámara de refrigeración transparente perfundida continuamente con aCSF a 6-8 °C, colocada en la plataforma basculante insertada en un cilindro metálico conectado con una placa Peltier para mantener la temperatura de la cámara. La preparación se alineó con el eje de rotación de la plataforma de modo que la estimulación vestibular estuviera en el plano de balanceo, evitando los movimientos de traslación, y frente al centro de dos pantallas colocadas a ambos lados a una distancia preparación-pantalla de 9 cm, asegurando que los estímulos presentados cubrieran todo el campo visual.

Todos los experimentos se llevaron a cabo en la oscuridad, por lo que la única fuente de luz era la estimulación visual. Los estímulos visuales consistían en barras horizontales que se movían en el eje vertical con direcciones opuestas en cada pantalla (es decir, cuando las barras presentadas al ojo derecho se movían de arriba hacia abajo, las barras frente al ojo izquierdo se movían de abajo hacia arriba). La dirección de las barras también se ajustó para analizar las respuestas OKR de guiñada y cabeceo.

Para analizar la integración visuovestibular se aplicó solo estimulación vestibular en el plano de balanceo (con las pantallas apagadas), solo estimulación visual (preparación mantenida horizontal) y estimulación visuovestibular (inclinación de la plataforma y estimulación visual combinada). Estos paradigmas se probaron en cuatro condiciones diferentes: baja amplitud—baja velocidad (5,8°; 48,7°/s), baja amplitud—alta velocidad (5,8°; 112,94°/s), alta amplitud—baja velocidad (22,7°; 48,7° /s) y alta amplitud: alta velocidad (22,7°; 112,94°/s). El ángulo se refiere a la inclinación máxima de la plataforma, y la velocidad angular a la velocidad de dicha inclinación y/o la velocidad de estimulación optocinética. Cada uno de los paradigmas (VIS, VES y VISVES) se aplicó tres veces a cada animal en cada condición (amplitud baja-velocidad baja, amplitud baja-velocidad alta, amplitud alta-velocidad baja y amplitud alta-velocidad alta). Las aceleraciones medias de los protocolos VES y VISVES fueron 305,75 ± 112,79 grados/s2 para baja velocidad y 915,73 ± 324,58 grados/s2 para alta velocidad. Esto se calculó conectando el acelerómetro utilizado en los estudios de comportamiento a la plataforma y recuperando su dinámica de movimiento. El electrodo de registro se colocó en el recto dorsal para registros de balanceo y cabeceo, y en el recto caudal para el plano de guiñada, y se mantuvo hasta la terminación del experimento. Después de colocar el electrodo, se dejó adaptar la preparación durante al menos 30 min con una pantalla blanca que sirvió de fondo para todos los estímulos aplicados. Se dejaron 2 min entre las pruebas y la presentación de las estimulaciones VIS, VES y VISVES se aleatorizó para minimizar la adaptación y compensar los posibles cambios en la excitabilidad de la preparación. El número de repeticiones realizadas en cada animal se eligió para minimizar la duración del experimento y adquirir datos suficientes para garantizar la viabilidad de la preparación en base a nuestra experiencia en estudios previos con preparaciones aisladas similares25,26,27. Las respuestas EMG a los protocolos específicos generalmente exhibieron una dinámica similar para cada animal. Esto nos permitió identificar ensayos en los que la integridad neuronal de la preparación se dañó de alguna manera, en cuyo caso se daría por terminado el experimento.

Para registrar la actividad muscular y/o neuronal, utilizamos microelectrodos de tungsteno (~1–5 MΩ) conectados a un amplificador de CA diferencial, modelo 1700 (sistemas AM). Las señales se digitalizaron a 20 kHz utilizando el software pClamp (versión 10.2). Los microelectrodos de tungsteno se colocaron mediante un micromanipulador firmemente fijado a la plataforma basculante, de manera que girase junto con la preparación evitando vibraciones. En algunos casos, también adjuntamos una cámara de video a la plataforma, para monitorear los movimientos oculares de la preparación.

Para realizar registros simultáneos de los músculos oculares extracelulares caudal y rostral y un par de raíces ventrales para evaluar la estabilización de la mirada durante la locomoción, utilizamos una preparación que expone el cerebro junto con los ojos y un gran segmento de la médula espinal. Para esto, anestesiamos profundamente a los animales con MS-222 (100 mgL−1; Sigma) y cortamos el cuerpo 50–60 mm caudalmente a la segunda abertura branquial (aproximadamente desde la ubicación del óbex). Luego, sumergidos en líquido cefalorraquídeo artificial enfriado con hielo (aCSF), se extrajeron la piel dorsal y el cartílago para exponer el cerebro y la médula espinal, y se extrajeron las vísceras y todos los músculos. Se seccionaron los nervios ópticos y se eliminaron los laberintos para evitar influencias visuales y vestibulares. Se usaron microelectrodos de tungsteno (~1–5 MΩ) para registrar la actividad muscular, mientras que se usaron electrodos de succión hechos de vidrio de borosilicato (HilgenbergGmbH) usando un tirador vertical (Modelo PP-830; Narishige) llenos de aCSF para registrar la actividad bilateral en el ventral raíces de la médula espinal. Los electrodos de succión se conectaron a un amplificador de CA diferencial, modelo 1700 (sistemas AM).

Se llevaron a cabo lesiones dirigidas para identificar el punto principal de transmisión de la información visual entre el ojo y los núcleos de los músculos extraoculares responsables de llevar a cabo el OKR. Para inactivar el tectum, se seccionó el tracto óptico justo caudal al pretectum, eliminando la entrada retinal a esta estructura. Para asegurarse de que el tectum estuviera desprovisto de fibras retinianas, se realizaron inyecciones de neurobiotina al final de los experimentos en el tracto óptico al nivel del pretectum, y los cerebros se procesaron como se describe a continuación para el trazado del tracto anatómico. El marcaje en el quiasma óptico se utilizó como referencia para confirmar que la inyección se realizó en el tracto óptico. Las lesiones pretectales se realizaron seccionándolas de forma aguda, y la misma estrategia se utilizó para inactivar el palio. También se realizó inactivación farmacológica para inactivar pretectum mientras se mantenía la integridad tectal (ver más abajo).

Las lampreas se anestesiaron profundamente con MS-222 y luego se seccionaron al nivel de la séptima branquia. La cabeza se sumergió en una solución de LCRa y las inyecciones se realizaron con micropipetas de vidrio (borosilicato; d.o. = 1,5 mm, d.i. = 1,17 mm; Hilgenberg) con un diámetro de punta de 10-20 μm. Las micropipetas se fijaron a un soporte conectado a un suministro de aire y un micromanipulador (modelo M-3333, Narishige), y 50-200 nL de Neurobiotin 20% (wt/vol) en aCSF que contiene Fast Green (Vector Laboratories) para ayudar a la visualización de el trazador se inyectó a presión en el oculomotor o en el núcleo octavomotor anterior/intermedio. Después de las inyecciones, los cerebros se mantuvieron sumergidos en aCSF en la oscuridad a 4 °C durante 24 h para permitir el transporte de los trazadores, y luego se diseccionaron los cerebros, se fijaron en formaldehído al 4 % y ácido pícrico saturado al 14 % en tampón de fosfato 0,1 M ( PB), pH 7,4, durante 12–24 h, y crioprotegido en sacarosa al 20 % (peso/vol) en PB durante 3–12 h. Se realizaron secciones transversales (20 μm de espesor) utilizando un criostato y se recogieron en portaobjetos recubiertos de gelatina. Para la detección de neurobiotina, se utilizó estreptavidina conjugada con Cy2 (1:1000; Jackson ImmunoResearch) junto con una tinción de Nissl de color rojo intenso (1:500; Molecular Probes), diluida en albúmina de suero bovino (BSA) al 1 %, Triton X- 100 en 0,1 M PB. Las secciones se montaron con glicerol que contenía un 2,5 % de diazabiciclooctano (Sigma-Aldrich).

Para etiquetar las neuronas AON que se proyectan al núcleo oculomotor para los experimentos de pinzamiento de parche, se inyectó a presión dextrano amina-tetrametilrodamina (3 kDa; 12 % en solución salina; Molecular Probes) unilateralmente en el tracto AON que se proyecta a nIII, al nivel del área ístmica . Para ello, los animales fueron anestesiados profundamente con MS-222 (100 mg·L−1) diluido en agua dulce, y durante la cirugía y las inyecciones se sumergió todo el animal en LCR que contenía MS-222 (80 mg·L−1 ) para asegurarse de que el animal se mantuvo anestesiado. Luego, se hizo una incisión en la piel y los músculos directamente sobre el tronco encefálico rostral, y se abrió el cartílago para exponer el cerebro. Después de las inyecciones, se suturó la piel dorsal y se devolvió al animal a su acuario durante 48 a 72 h para permitir el transporte del marcador. Luego, los cerebros se diseccionaron y se procesaron para grabaciones de abrazadera de parche (ver más abajo).

Se realizaron grabaciones de abrazadera de corriente de células enteras en cortes gruesos manteniendo el pretectum para la estimulación y exponiendo las neuronas AON para la grabación. Para ello, todo el cerebro se embebió en agar (4% en aCSF), y el bloque de agar que contenía el cerebro se pegó a una placa de metal, se transfirió rápidamente a aCSF enfriado con hielo y se cortaron rodajas utilizando un microtomo vibratorio (Microm HM 650 V; Thermo Scientific). Posteriormente, el bloque de agar se montó en una cámara de registro sumergida.

Los registros de abrazadera de corriente de células enteras se llevaron a cabo utilizando pipetas de parche hechas de vidrio de borosilicato (Hilgenberg GmbH) y se obtuvieron utilizando un tirador vertical (Modelo PP-830; Narishige). La resistencia de las pipetas de registro fue de 7 a 10 MΩ cuando se llenaron con una solución intracelular con la siguiente composición (en mM): 130 gluconato de potasio, 5 KCl, 10 sal de fosfocreatina disódica, 10 HEPES, 4 Mg-ATP, 0,3 Na-GTP ; (osmolaridad 265–275 mOsmol). En algunos casos, la solución de electrodos incluía bromuro de trietilamonio 2 mM (QX314; Sigma-Aldrich) para bloquear los potenciales de acción. El equilibrio del puente y la compensación de la capacitancia de la pipeta se ajustaron para usar un amplificador de parche MultiClamp 700B y un convertidor de analógico a digital Digidata 1322 bajo el control del software 'PClamp 10.2' (Molecular Devices). La preparación se perfundió constantemente con aCSF a 6-8°.

La estimulación del pretectum/tracto óptico se realizó con los mismos microcapilares de vidrio de borosilicato que se utilizan para los registros de parches, conectados a una unidad de aislamiento de estímulos (MI401; Instituto Zoológico, Universidad de Colonia). La intensidad de la estimulación se fijó en una o dos veces la fuerza del umbral (típicamente 10-100 μA) para evocar PSP.

Para analizar los movimientos oculares en respuesta a la natación sin influencias visuales ni vestibulares, utilizamos una preparación semiintacta que expone el cerebro y los ojos mientras deja intacto el resto del cuerpo. Para ello, los animales fueron anestesiados con MS-222 (100 mg·L−1) diluido en agua dulce, y se extrajo la piel dorsal, músculos y cartílagos de la cabeza del animal, de manera que el cerebro, cápsulas óticas y se expusieron los ojos para permitir la disección de los nervios y laberintos ópticos, y la monitorización de los ojos. Se dejó recuperar la preparación y se registraron los episodios de nado espontáneo y evocado (pinzando suavemente la cola con pinzas) y los movimientos oculares, utilizando una cámara de video acoplada al microscopio. Para asegurarse de que el sistema oculomotor estaba intacto, se controlaron los movimientos oculares para todas las preparaciones, tanto espontáneas como provocadas por estimulación eléctrica del tracto óptico. Los movimientos de los ojos y la cola se rastrearon utilizando DeepLabCut como se describe anteriormente. Se colocaron cuatro etiquetas en cada ojo y dos etiquetas en el cuerpo rostral del animal para promediar los datos y así minimizar los errores en las trayectorias inferidas del ojo y el cuerpo.

Para aplicar estimulaciones vestibulares de gran amplitud en el plano de guiñada, desarrollamos una plataforma movida por un servomotor controlado vía Arduino, de manera que se pudiera controlar la velocidad y la amplitud. En cuanto a las grabaciones VOR (ver arriba), se fijó en la plataforma giratoria una cámara transparente con el tamaño adecuado para evitar que el animal pudiera nadar, llena de agua fría aireada. La cabeza del animal se alineó con el eje de rotación para evitar movimientos de traslación y se colocó una cámara de video (Grasshopper3, GS3-U3-23S6M-C, FLIR Systems) frente a uno de los ojos. Se aplicaron rotaciones de 180° o 360° a diferentes velocidades, y los movimientos oculares se rastrearon usando DeepLabCut y se analizaron usando scripts Matlab personalizados.

Para probar el papel del pretectum en la mediación de OKR manteniendo la integridad tectal durante los registros de EMG, se aplicó localmente en el pretectum el antagonista del receptor de glutamato ácido quinurénico (4 mM; Sigma-Aldrich) mediante inyección a presión a través de una micropipeta fijada a un soporte (que contiene Fast Green para facilitar la visualización de la extensión de la inyección), que se conectó a un sistema de dispensación de microinyección Picospritzer-II (Parker). El soporte se conectó a un micromanipulador para monitorear la posición de la pipeta y garantizar inyecciones precisas de medicamentos. Para evocar la locomoción ficticia mientras se monitorean los movimientos oculares con las grabaciones de EMG, usamos una cámara dividida que separa la médula espinal expuesta del cerebro, y el agonista del receptor de N-metil-D-aspartato D-Glutamato (0,75 mM, Sigma-Aldrich) se bañó. aplicado a la médula espinal.

Las microfotografías se tomaron con una cámara digital (Olympus XM10) montada en un microscopio de fluorescencia Olympus BX51. Las ilustraciones se realizaron con Adobe Illustrator CC 2019 y GIMP 2.1 (programa manipulador de imágenes GNU). Las imágenes solo se ajustaron en brillo y contraste. Se obtuvieron pilas Z confocales de secciones ópticas utilizando un microscopio de barrido Zeiss Laser 510, y las imágenes de proyección se procesaron utilizando el software Zeiss LSM, ImageJ 1.53k y GIMP 2.1.

Para todos los registros electrofisiológicos, el análisis de datos se realizó utilizando funciones escritas personalizadas en Matlab. Para las grabaciones de video, las posiciones se extrajeron utilizando DeepLabCut30. Para calcular la ganancia durante la estimulación VOR, se utilizaron dos estrategias diferentes. Por un lado, la ganancia de posición se calculó como la relación de las áreas bajo la curva de las posiciones de la cabeza y los ojos durante un intervalo de tiempo específico. Para la ganancia dinámica, se calcularon las relaciones entre las velocidades del ojo y la cabeza entre dos puntos diferentes64. En ambos casos se calculó la ganancia durante la fase lenta del VOR, evitando movimientos nistagmicos de fase rápida. Para cuantificar la duración de las fases rápida y lenta del nistagmo, se realizó un análisis fotograma a fotograma utilizando Adobe Premiere. Esto nos permitió identificar la posición inicial y final exacta de cualquier movimiento ocular con un alto nivel de precisión, y los puntos de tiempo se registraron para calcular la duración y las amplitudes medidas en píxeles y luego convertidas en grados como se expone anteriormente. Las amplitudes se calcularon midiendo la distancia en píxeles recorrida por el ojo entre estos fotogramas clave y luego se convirtieron en ángulos como se muestra arriba.

Para EMG y registros extracelulares, se cuantificó el número de picos para compararlos después de diferentes condiciones. También se midieron las amplitudes máximas: las señales se rectificaron por completo y se calculó la distancia desde la línea de base hasta los picos como una forma de medir las amplitudes. Dado que en los EMG obtenidos en respuesta a la estimulación eléctrica del ojo no se pueden extraer unidades aisladas, se comparó la integral bajo las curvas después de rectificar completamente las señales mediante integración numérica trapezoidal (función 'trapz'), como una forma de integrar la amplitud y Duración de las señales. Para el análisis completo de la grabación, las amplitudes de los PSP se midieron después de ajustar la descomposición sináptica mediante una curva exponencial para extraer las amplitudes correctas, ya que los PSP posteriores a menudo comenzaban en la fase de descomposición de las respuestas anteriores. Las respuestas registradas en cada animal fueron altamente consistentes entre todas las repeticiones aplicadas de cada paradigma (VIS, VES o VISVES). Sin embargo, se observaron diferencias entre animales debido a la ubicación del electrodo y la excitabilidad de la preparación. Por lo tanto, los datos se normalizaron, dividiendo todos los valores a la máxima respuesta en cada animal y para cada modalidad. De esta forma, se obtuvo la relación de cada modalidad sensorial para cada animal y cada condición experimental (baja amplitud-baja velocidad, baja amplitud-alta velocidad, alta amplitud-baja velocidad y alta amplitud-alta velocidad). Luego se promediaron los datos entre los animales, obteniendo la contribución media de cada modalidad sensorial representada en las parcelas.

Para el análisis estadístico, se agruparon todos los trazos para cada variable dependiente e independiente. El análisis se realizó con SPSS 25 y JASP 0.16. En algunos casos, los movimientos oculares espontáneos se generaron inmediatamente antes o después de la estimulación, afectando claramente las respuestas analizadas. Después de inspeccionar visualmente los valores atípicos putativos, se usó una prueba de Grubb para identificar los valores atípicos significativos, y los puntos de datos fuera del intervalo de confianza del 95 % se eliminaron antes de realizar el análisis estadístico. Se utilizaron pruebas T pareadas para comparar las amplitudes de la señal y el número de picos entre las modalidades en α = 0,05. A lo largo de las figuras, las estadísticas de la muestra se expresan como medias ± DE. Los valores que caen fuera del intervalo de confianza del 95% según la prueba de Grubb se excluyeron de las parcelas. Para analizar las rampas visuales de los planos de balanceo y cabeceo, se implementó un ANOVA de medidas repetidas con los respectivos incrementos de estimulación como factores. Se utilizaron análisis de regresión lineal para los ensayos de comportamiento, recuperando el coeficiente de coherencia de Pearson para probar la conjugación entre los dos ojos, así como entre los movimientos promedio de los ojos y la cola; para este último, las posiciones de los ojos se compensaron siete cuadros hacia adelante en el tiempo para que coincidieran con el inicio del movimiento de la cola. El número de experimentos realizados para los cuales se muestran ejemplos representativos es el siguiente: Para el análisis de ganancia (Fig. 1b-d), se aplicó estimulación vestibular en los tres planos a tres animales. Se analizaron tres repeticiones por cada plano de estimulación por animal. Las inyecciones de neurobiotina se realizaron en el nIII de tres animales (Fig. 5) y en el AON de cuatro animales (Fig. 7b-f). Se realizaron experimentos de nistagmo en tres animales (Fig. 8). Los experimentos para analizar la presencia de movimientos oculares provocados por la locomoción en una preparación semiintacta se realizaron en seis animales (Fig. 9). La significancia estadística se muestra a continuación: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos fuente se proporcionan con este documento y se pueden descargar en el siguiente enlace (https://doi.org/10.5281/zenodo.6628365), junto con datos brutos adicionales65. Mayores informaciones y solicitudes deben dirigirse al autor de correspondencia.

El código utilizado para el análisis y presentación de los estímulos visuales y vestibulares en coordinación con los registros electrofisiológicos se puede descargar en el siguiente enlace: (https://doi.org/10.5281/zenodo.6628365)65. Mayores informaciones y solicitudes deben dirigirse al autor de correspondencia.

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Agradecemos al profesor Abdel El Manira y a la Dra. Brita Robertson por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito, a Roberto de la Torre por la cámara de video y a Roi Carrera Boo por configurar DeepLabCut. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación Médica (VR-M-K2013-62X-03026, VR-M-2015-02816, VR-M-2018-02453 para SG y VR-M-2019-01854 para JP- F.), Proyectos I+D+i PID2020-113646GA-I00 financiado por MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 y por "FEDER Una forma de hacer Europa" (a JP-F.), la beca Ramón y Cajal RYC2018-024053 -I financiado por MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 y por "ESF Investing in your Future" (a JP-F.), Xunta de Galicia (ED431B 2021/04 a JP-F.), EU/FP7 Moving Beyond grant ITN -No-316639, Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) bajo el acuerdo de subvención no.604102 (HBP), EU/Horizon 2020 no.720270 (HBP SGA1), no. 785907 (HBP SGA2) y no. 945539 (HBP SGA3) a SG, CINBIO, la Fundación Gösta Fraenckel para la Investigación Médica FS-2020:0004 (a TW), la Fundación de Investigación Sigvard y Marianne Bernadotte para el Cuidado de los Ojos Infantiles y el Instituto Karolinska.

El Departamento de Neurociencia, Karolinska Institutet, Estocolmo, Suecia

Tobias Wibble, Sten Grillner & Juan Pérez-Fernández

El Departamento de Neurociencia Clínica, Marianne Bernadotte Centrum, St: Erik's Eye Hospital, Karolinska Institutet, Estocolmo, Suecia

Tobias Wibble y Tony Pansell

CINBIO, Universidad de Vigo, Grupo de Neurocircuitos, Campus Universitario de Lagoas, Marcosende, 36310, Vigo, España

Juan Pérez-Fernández

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TW y JP-F. concibió el estudio y diseñó y llevó a cabo los experimentos. SG contribuyó al marco teórico, brindó comentarios críticos y suministró equipos y materiales. TP proporcionó apoyo financiero y supervisión. JP-F. diseñó las figuras con aportes de TWTW y JP-F. realizó el análisis, interpretó los resultados y escribió el manuscrito con aportes de todos los autores.

Correspondence to Juan Pérez-Fernández.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Bernd Fritzsch y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Wibble, T., Pansell, T., Grillner, S. et al. Procesamiento subcortical conservado en el control de la mirada viso-vestibular. Nat Comun 13, 4699 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32379-w

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Recibido: 10 Agosto 2021

Aceptado: 27 julio 2022

Publicado: 10 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32379-w

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