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Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 730 (2022) Citar este artículo

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Mantener el equilibrio hídrico es un verdadero desafío para los anfibios en ambientes terrestres. Nuestros estudios previos con el sapo Bombina maxima descubrieron una proteína formadora de poros y un complejo de factor de trébol βγ-CAT, que se ensambla bajo una estricta regulación dependiendo de las señales ambientales. Aquí informamos un papel inesperado para βγ-CAT en el mantenimiento del agua de sapo. La eliminación de las secreciones de piel de sapo, en las que βγ-CAT es un componente principal, aumentó la mortalidad animal bajo estrés hipertónico. βγ-CAT se expresó constitutivamente en órganos osmorreguladores de sapo, que fue inducible bajo la variación de las condiciones osmóticas. La proteína indujo y participó en la macropinocitosis in vivo e in vitro. Durante la hiperosmosis extracelular, βγ-CAT estimuló la macropinocitosis para facilitar la importación de agua y la liberación mejorada de exosomas, lo que regulaba simultáneamente la distribución de las acuaporinas. En conjunto, estos hallazgos descubrieron que, además de la acuaporina integrada en la membrana, una proteína secretora formadora de poros puede facilitar el mantenimiento del agua del sapo a través de la inducción de macropinocitosis y la modulación de la exocitosis, especialmente en las respuestas al estrés osmótico.

Mantener el equilibrio hídrico es un desafío clave que enfrentan los anfibios en el proceso de transición del agua a la tierra1,2. En estos animales, la función coordinada de los sistemas nervioso, endocrino y linfático y los órganos involucrados en el equilibrio agua-sal y la osmorregulación (incluyendo la piel, la vejiga y los riñones) da como resultado un mejor almacenamiento y utilización del agua y una evaporación reducida1,3. Los anfibios son capaces de absorber agua a través de su piel1,2. Además, el agua se reabsorbe del líquido tubular en el riñón y de la orina almacenada en la vejiga urinaria (UB)2,3. Las proteínas de los canales de agua, las acuaporinas (AQP), desempeñan un papel clave en la absorción/reabsorción de agua transepitelial en estos órganos y en la regulación del volumen celular4,5. Sin embargo, rara vez se ha estudiado la función fisiológica de los componentes proteicos de las secreciones cutáneas de anfibios en la regulación de la homeostasis del agua tegumentaria.

La macropinocitosis es un mecanismo que media la captación masiva y la internalización del líquido extracelular y los solutos que contiene, produciendo vesículas endocíticas con diámetros de 0,2 a 5 μm6,7. La macropinocitosis es una vía endocítica dependiente de actina mediada por la activación de las vías de señalización de Ras y fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), que es inducida por agentes endógenos como factores de crecimiento o por microbios invasivos6,8. Se ha documentado que este proceso celular fundamental desempeña varias funciones fisiopatológicas en una variedad de células normales y malignas, incluida la adquisición de nutrientes, el crecimiento celular, el tráfico y la renovación de los componentes de la membrana, la entrada de patógenos, la vigilancia inmunitaria y la motilidad celular6,9, 10 Sin embargo, las funciones fisiológicas de la macropinocitosis, una forma muy antigua de endocitosis, siguen sin entenderse del todo11,12.

Las proteínas formadoras de poros (PFP) suelen ser proteínas secretoras que existen en una forma monomérica soluble en agua y se oligomerizan para formar poros transmembrana (canales)13,14. Las aerolisinas son PFP de barril β bacterianas producidas por especies de Aeromonas13,14. Curiosamente, se han identificado numerosas PFP de la familia de aerolisinas (abreviadas af-PFP, anteriormente denominadas Aerolysin-Like Proteins, ALP) que albergan un dominio de inserción de membrana de aerolisina fusionado con otros dominios en varios animales y plantas15,16. Nuestros estudios previos con las secreciones de la piel del sapo Bombina maxima descubrieron una red de interacción entre las af-PFP y los factores del trébol (TFF)17. BmALP1, una af-PFP del sapo, puede regularse reversiblemente entre las formas activa e inactiva, en la que su parálogo BmALP3 es un regulador negativo dependiente de la tensión de oxígeno ambiental18. Específicamente, BmALP1 interactúa con BmTFF3 para formar un complejo PFP activo en la membrana llamado βγ-CAT19,20, en el que BmTFF3 actúa como un chaperón extracelular que estabiliza el monómero BmALP1 y entrega este PFP a sus objetivos de membrana adecuados18,21.

Este complejo secretor de PFP βγ-CAT se dirige a gangliósidos y sulfátidos en las membranas celulares en un modelo de unión de doble receptor21. Luego, la subunidad BmALP1 se somete a endocitosis y esta PFP se oligomeriza para formar canales en los endolisosomas, modulando el contenido y las propiedades bioquímicas de estos orgánulos intracelulares21,22,23,24,25. Por lo tanto, βγ-CAT es una proteína del canal del endolisosoma secretor (SELC). Hemos planteado la hipótesis de que este complejo PFP en realidad representa una vía SELC hasta ahora desconocida, que se caracteriza por mediar en la importación y exportación de material celular a través de vías endolisosomales17. Según los contextos celulares y el entorno, se ha propuesto que βγ-CAT promueve el sentido y la absorción de materiales ambientales (como nutrientes y antígenos) en el sapo y facilita la exportación de moléculas de carga importadas en sus formas intactas y/o productos procesados ​​a través de estimular la liberación de vesículas extracelulares17. Por lo tanto, los efectos celulares de la proteína SELC βγ-CAT podrían mediar en el intercambio de material entre las células y los entornos, al tiempo que mantienen la función de barrera de la mucosa y cumplen con la defensa inmunitaria17. En consecuencia, las funciones de βγ-CAT en la defensa inmunitaria se han documentado por primera vez22,23,24,25,26.

La piel de los anfibios es un órgano principal responsable de la adquisición y el mantenimiento del agua1,3, y la βγ-CAT es un componente principal de las secreciones cutáneas de B. maxima18. En el presente estudio, encontramos que la expresión y localización de βγ-CAT en sapo B. maxima están relacionadas con las condiciones osmóticas ambientales, y que esta proteína es capaz de contrarrestar la deshidratación celular bajo hiperosmosis extracelular. βγ-CAT estimuló y participó en la macropinocitosis celular y la liberación de exosomas, promoviendo la captación de agua y Na+ y regulando la localización de AQP. En conjunto, estos resultados revelaron que una PFP secretora puede impulsar la adquisición y el mantenimiento del agua.

La piel de los anfibios ha jugado un papel dual en la osmorregulación durante la adaptación evolutiva a los ambientes terrestres27. En consecuencia, cuando se expusieron a la solución de Ringer hipertónica, los sapos (B. maxima) perdieron peso rápidamente, que se recuperó gradualmente cuando el animal se colocó en la solución de Ringer isotónica (Fig. 1a). Esto sugiere que el sapo transporta agua a través de su piel en condiciones de estrés osmótico. Las secreciones de la piel juegan un papel fundamental en las funciones fisiológicas de la piel de los anfibios2. Además, βγ-CAT es un componente proteico principal de las secreciones de la piel en el sapo B. maxima18. Se estimó que dos subunidades de βγ-CAT juntas representan aproximadamente el 50% de las proteínas en las secreciones cutáneas de B. maxima (Fig. 1a complementaria). Especulamos que las secreciones de piel de sapo, especialmente βγ-CAT, podrían desempeñar un papel activo en el equilibrio hídrico. Se realizaron experimentos de estrés osmótico para probar las posibles funciones de las secreciones cutáneas que contienen βγ-CAT en el mantenimiento del equilibrio hídrico en el sapo. Los sapos B. maxima perdieron el 20% de su peso corporal y el 50% de los animales murieron cuando se colocaron en la solución de Ringer hipertónica durante 24 horas (Fig. 1b y Fig. 1b complementaria). Las secreciones de piel de sapo se agotaron mediante electroestimulación 30 minutos antes de colocar los sapos en diferentes soluciones osmóticas. Aunque no se registraron muertes de sapos después de la electroestimulación en la solución de Ringer isotónica, la mortalidad se produjo en la solución de Ringer hipertónica (Fig. 1b). Por lo tanto, parece que las secreciones de la piel son fundamentales para que el sapo pueda hacer frente a los entornos hipertónicos. Para investigar más a fondo la posible participación de βγ-CAT en el balance hídrico del sapo, se usó qPCR para detectar la expresión de dos subunidades βγ-CAT en la piel, UB y riñón del sapo B. maxima durante la deshidratación y recuperación de peso (absorción de agua después de deshidración). Se encontró que la expresión de la subunidad α βγ-CAT se regulaba al alza en la piel y el riñón durante la recuperación de peso a través de la absorción de agua después de la deshidratación (Fig. 1c y Fig. 1c complementaria). Por el contrario, la expresión del ARNm de la subunidad β de βγ-CAT aumentó en la piel de sapo durante la deshidratación o la absorción de agua (Fig. 1d), pero no en el riñón (Fig. 1d complementaria). Curiosamente, en la UB, los niveles de ARNm de ambas subunidades aumentaron cuando los sapos se expusieron a la solución de Ringer hipertónica y volvieron al nivel normal cuando los sapos se colocaron posteriormente en la solución de Ringer isotónica (Fig. 1e, f). Por lo tanto, la expresión de βγ-CAT está asociada con cambios en las condiciones osmóticas externas.

Se midieron los cambios de peso de los sapos después de colocarlos en soluciones de Ringer isotónicas, hipertónicas e hipertónicas/isotónicas. El peso inicial de los sapos es de 19 ± 5 g (n = 5). b Las tasas de supervivencia de sapos en solución de Ringer isotónica (i) e hipertónica (h) se determinaron después de 48 horas. Los sapos se colocaron en cada una de las soluciones después de 30 minutos con (+) o sin (-) electroestimulación para eliminar las secreciones de la piel del sapo (n = 6). c – f La expresión de las subunidades βγ-CAT en piel de sapo y UB se analizó mediante PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real (n = 6). Los sapos se colocaron en solución de Ringer isotónica o hipertónica durante 3 horas antes de recolectar las muestras. En el grupo hipertónico/isotónico, los sapos se colocaron primero en la solución hipertónica durante 3 horas, luego se trasladaron a la solución isotónica durante 3 horas más antes de recolectar las muestras. g, h Después de la colocación de sapos en solución de Ringer isotónica, hipertónica o hipertónica/isotónica como se describió anteriormente, la localización y expresión de βγ-CAT en los tejidos de piel de sapo (g) y UB (h) se analizaron mediante inmunohistofluorescencia (IHF). Ep epidermis, De dermis, Mg glándula mucosa, Gg glándula granular, Lu lumen, Te epitelio de transición. Barras de escala, 200 μm. *P < 0,05 y **P < 0,01 según la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon en el análisis de la tasa de supervivencia. ns (P ≥ 0,05); *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001 mediante la prueba t no pareada en otros experimentos. Todos los datos representan la media ± SD y son representativos de al menos dos experimentos independientes. Véase también la Fig. 1 complementaria.

Además, analizamos la expresión y localización de la proteína βγ-CAT en las mismas condiciones de tratamiento mediante inmunohistofluorescencia (IHF). βγ-CAT se concentró principalmente dentro de la epidermis y las glándulas de la piel, y se reguló positivamente en la epidermis y la membrana basal durante el estrés osmótico (Fig. 1g). βγ-CAT se localizó predominantemente dentro del epitelio de transición en la UB. La expresión de la proteína βγ-CAT en la UB de sapo aumentó en solución de Ringer hipertónica y disminuyó cuando el sapo se colocó en solución de Ringer isotónica (Fig. 1h). En conjunto, estos resultados revelaron una participación de βγ-CAT en las respuestas del sapo al estrés osmótico.

βγ-CAT es una proteína funcional vital del sapo B. maxima, y ​​su expresión constitutiva se puede detectar en varios tejidos de sapo22,23, incluidas las secreciones cutáneas y las células epiteliales de la piel y la UB, así como las células renales y peritoneales. La secreción endógena de βγ-CAT en estas células derivadas de sapo se analizó más a fondo mediante un ensayo de hemólisis, un método sensible para detectar la presencia de βγ-CAT biológicamente activa18,19. Todos los medios de estas células de sapo cultivadas mostraron una potente actividad hemolítica, que fue totalmente inhibida por los anticuerpos anti-βγ-CAT, lo que confirma la presencia de βγ-CAT secretada (Fig. 2a complementaria). Además, medimos la citotoxicidad de βγ-CAT en células de B. maxima. Previamente, se informó que βγ-CAT no mostró citotoxicidad para las células peritoneales de sapo en dosis de hasta 400 nM22. El presente estudio determinó además que la citotoxicidad de βγ-CAT en las células epiteliales de la piel y UB y las células renales de B. maxima se produjo solo cuando su concentración alcanzó los 2 μM (Fig. 2b complementaria), un nivel mucho más alto que las concentraciones fisiológicas (20-100 nM, según lo determinado en el peritoneo de sapo)22. Por el contrario, las células de mamíferos son mucho más sensibles a βγ-CAT. Aunque βγ-CAT no mostró citotoxicidad para las células MDCK, Caco-2 y T24 a 10 nM, la proteína causó la muerte celular cuando las dosis utilizadas fueron superiores a 50–100 nM (Fig. 2c complementaria). Así, en todos los experimentos posteriores relacionados con la adición de βγ-CAT purificada a las células, las dosis de proteína utilizadas fueron: células epiteliales de piel de sapo, 100 nM; células epiteliales UB, 50 nM; células peritoneales, 50 nM; MDCK de mamífero, 10 nM; Caco-2, 10 nM; y T24, 5 nM.

Para explorar más a fondo el papel potencial de βγ-CAT en el transporte de agua, investigamos si la proteína es capaz de contrarrestar la deshidratación celular bajo hiperosmosis extracelular. Confirmamos la acción de βγ-CAT en células epiteliales UB de sapo, células MDCK, Caco-2 y T24 de mamíferos, según lo determinado por la formación de oligómeros de βγ-CAT después del tratamiento con la proteína (Fig. 2a y Suplementario Fig. 2d). Se detectaron oligómeros de βγ-CAT en células epiteliales de UB de sapo sin la adición de la proteína, posiblemente causada por βγ-CAT secretada endógenamente (Fig. 2a). La adición de βγ-CAT purificada aumentó aún más la concentración de oligómeros de la proteína en las células epiteliales UB (Fig. 2a). Luego, analizamos las características electrofisiológicas de los oligómeros βγ-CAT en parches de afuera hacia afuera de células HEK293. Las corrientes macroscópicas inducidas por βγ-CAT se registraron y normalizaron, lo que tiene la característica de rectificación interna (Fig. 2b). Estos demostraron que βγ-CAT podría formar poros transmembrana (canales) y mediar en el flujo de iones después de la oligomerización en la membrana. Investigamos más a fondo la selectividad de iones de los canales βγ-CAT a través de experimentos de reemplazo de iones. Las soluciones asimétricas de NaCl 150:15 mM desplazaron a la izquierda el potencial de inversión de 0 mV a −61,2 mV, que está muy cerca del potencial de equilibrio teórico de Na+, lo que indica que los canales βγ-CAT son permeables a Na+ pero no a Cl− ( Figura 2c). Estos resultados demostraron que los canales βγ-CAT permitían el flujo de Na+.

Se trataron células de vejiga urinaria de sapo y células MDCK con o sin βγ-CAT durante 15 minutos. La aparición de oligómeros de βγ-CAT en las células tratadas se determinó mediante transferencia Western. b Curvas corriente-voltaje normalizadas de canales formados por βγ-CAT 100 nM en células HEK293. Las corrientes se obtuvieron mediante un protocolo de rampa de 500 ms entre -100 mV y +100 mV cada 2 segundos desde un potencial de mantenimiento de 0 mV (n = 3). c Curvas corriente-voltaje normalizadas de los canales βγ-CAT en las soluciones indicadas (pipeta/baño) (n = 3). Na+(150:15 mM) representa el Na+ 150 mM en la pipeta y el Na+ 15 mM en el baño. d Cambios en el diámetro de las células MDCK, Caco-2 y T24 en PBS isotónico (295 mOsm) o hipertónico (400 mOsm) en presencia o ausencia de βγ-CAT según lo determinado mediante el uso de un contador de células. Las células digeridas se suspendieron primero en PBS durante 15 minutos antes de usarlas en este experimento. e, f Cambios en el diámetro de las células epiteliales UB de sapo en solución de Ringer isotónica (negra) e hipertónica (verde) en presencia de 50 μg mL−1 de anticuerpo de conejo (azul) o anticuerpo anti-βγ-CAT (magenta). En (f), las células se trataron primero con HgCl2 0,3 mM durante 10 minutos antes de medir el diámetro de las células con un contador de células. En todos los experimentos que se muestran en la Fig. 2, las dosis de βγ-CAT utilizadas fueron 10 nM para MDCK y Caco-2, 5 nM para T24 y 50 nM para células epiteliales UB de sapo. Las barras representan la media ± DE de muestras por triplicado en b–e. Las barras representan la media ± DE de tres réplicas independientes en f. ns (P ≥ 0,05), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001 por la prueba t no pareada. Todos los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes. Véase también la Fig. 2 complementaria.

Sobre esta base, exploramos el papel potencial de βγ-CAT cuando las células fueron desafiadas por hiperosmosis extracelular utilizando una solución hipertónica. Observamos que βγ-CAT promovió la recuperación de volumen de las células MDCK, Caco-2 y T24 en solución hipertónica (Fig. 2d), revelando la capacidad de la proteína para facilitar la captación de agua en condiciones hiperosmóticas. De acuerdo con esas observaciones, el agotamiento inmunológico de βγ-CAT endógeno disminuyó aún más los diámetros celulares de las células epiteliales UB de sapo en solución de Ringer hipertónica en relación con aquellas en ausencia de anticuerpos anti-βγ-CAT (Fig. 2e). Está bien documentado que las AQP pueden mediar en el rápido flujo celular de agua28. Por lo tanto, es necesario aclarar si la recuperación del volumen celular por captación de agua mediada por βγ-CAT bajo estrés osmótico se asoció con la función AQP. Debido a que los sitios sensibles al mercurio de B. maxima AQP (BmAQP) en la UB se conservaron evolutivamente (Figura complementaria 2e, f), se usó HgCl2 para inhibir la función de BmAQP. El volumen celular no cambió en la solución de Ringer hipertónica después de bloquear las BmAQP con HgCl2. Por el contrario, la recuperación del volumen celular de las células epiteliales UB de sapo a través de la absorción de agua se redujo claramente después del inmunoagotamiento de βγ-CAT endógeno (Fig. 2f). En conjunto, estos resultados revelaron la capacidad de βγ-CAT para promover la recuperación del volumen celular al estimular la adquisición de agua durante la hiperosmosis extracelular e indicaron que el efecto era independiente del flujo de agua a través de las AQP de la membrana plasmática.

βγ-CAT participa en la regulación del volumen celular, lo que sugiere su implicación en el transporte de agua. A continuación, analizamos el posible mecanismo celular detrás de este fenómeno. La adquisición de agua se puede realizar rápidamente a través de AQP y/o macropinocitosis12,28,29. Previamente, βγ-CAT mejoró la pinocitosis en un modelo de células dendríticas (DC) murinas24. En el presente estudio, estudiamos cuidadosamente la capacidad de βγ-CAT para estimular y participar en la macropinocitosis en varios tipos de células B. maxima. Primero, la microscopía inmunoelectrónica (IEM) reveló que βγ-CAT se localizó en pseudópodos celulares y macropinosomas con diámetros de hasta 300 nm formados por macropinocitosis en piel de sapo y tejidos UB (Fig. 3a). βγ-CAT también estaba presente en los espacios intercelulares de las células epiteliales (Fig. 3a). El dextrano de 70 kDa es un marcador de macropinocitosis, mientras que Lucifer Yellow (LY) puede utilizarse como marcador de endocitosis en fase líquida, incluida la macropinocitosis30,31. En células epiteliales obtenidas de piel de sapo y UB, y en riñón de sapo o células peritoneales, la inmunodepleción de βγ-CAT endógena por anticuerpos anti-βγ-CAT disminuyó en gran medida la internalización de LY y FITC-dextrano, en relación con las células observadas en presencia de control conejo IgG (Fig. 3b, cy Complementario Fig. 3a, b). Sorprendentemente, la IgG de conejo de control agregada exógenamente puede inducir pinocitosis. La presencia generalizada de receptores de IgG (p. ej., FcRn) en las células puede contribuir en parte al efecto32. De hecho, el gen similar a FcRn de B. maxima también estaba presente en las células de sapo (Fig. 3c complementaria). Por razones desconocidas, la IgG de conejo contribuye a la pinocitosis de las células de sapo como proteína exógena. Descubrimos que la IgG de conejo de control y los anticuerpos derivados de conejo anti-βγ-CAT eran igualmente potentes para inducir macropinocitosis en células MDCK (Fig. 3d complementaria). Por lo tanto, estos demostraron que los anticuerpos derivados de conejo anti-βγ-CAT pueden reducir la macropinocitosis inducida por βγ-CAT por inmunodepleción de βγ-CAT endógeno. Además, la adición de βγ-CAT a células de piel de sapo y UB, y células MDCK y T24 de mamíferos mejoró la internalización de LY y FITC-dextrano (Fig. 3d, e y Fig. 3e, f complementaria). Descubrimos que βγ-CAT se sometió a endocitosis y se ubicó en los macropinosomas de las células MDCK (Fig. 3g complementaria). Además, las concentraciones totales de Na+ en células epiteliales UB de sapo y células MDCK tratadas con βγ-CAT fueron 3,5 y 1,1 veces mayores que las del grupo del vehículo, respectivamente (Fig. 3f).

a Localización ultraestructural de βγ-CAT en piel de sapo y tejidos UB analizados por IEM. Vehículo (control IgG de conejo). Vesículas endocíticas formadas por macropinocitosis (asteriscos negros) y distribución de βγ-CAT en vesículas (flechas rojas) y espacios intercelulares (triángulos rojos). b, c El inmunoagotamiento de βγ-CAT endógeno disminuyó la macropinocitosis. Las células epiteliales de piel de sapo (b) y UB (c) se incubaron con 50 μg mL-1 de anticuerpo anti-βγ-CAT para inmunodepletar el βγ-CAT endógeno durante 30 min. La intensidad de fluorescencia media se determinó mediante citometría de flujo con 100 μg mL−1 de dextrano marcado con FITC de 70 kDa y Lucifer Yellow (LY) durante 30 minutos. IgG de conejo (control de anticuerpos). Vehículo (anticuerpo sin control). d, e La adición de macropinocitosis aumentada con βγ-CAT purificada. La intensidad de fluorescencia media del dextrano marcado con LY y FITC en células epiteliales de piel de sapo (d) y UB (e) se determinó mediante citometría de flujo con o sin βγ-CAT adicional 100 nM o 50 nM, respectivamente. f Cambios de pliegue de [Na+] en células epiteliales UB de sapo (n = 6) y células MDCK (n = 8) con y sin la adición de βγ-CAT 50 nM o 10 nM durante 3 horas, respectivamente. g, h El efecto de los inhibidores sobre la macropinocitosis inducida por βγ-CAT. Se incubaron células epiteliales UB de sapo (g) y células MDCK (h) con y sin EIPA 100 μM o WORT 20 μM durante 1 hora. Luego, las células se cultivaron con 100 μg mL-1 de dextrano marcado con FITC con 50 nM (células UB de sapo) o 10 nM (células MDCK) βγ-CAT durante 30 minutos. i Rac123 y fosforilación de Akt y PI3K en respuesta a βγ-CAT 10 nM en células MDCK durante 15, 30 o 60 minutos según lo determinado por transferencia Western y las bandas se semicuantificaron con ImageJ. La línea punteada negra se refiere al control en blanco y los datos representan la media ± SD de muestras por triplicado en be, g, h. Los datos representan la media ± SD de al menos tres réplicas independientes en f e i. ns (P ≥ 0,05), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001 por la prueba t no pareada. Todos los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes. Véase también la Fig. 3 complementaria.

A continuación, se investigó el mecanismo molecular de la macropinocitosis inducida por βγ-CAT utilizando agentes farmacológicos. La 5-(N-etil-N-isopropil) amilorida (EIPA, un inhibidor del intercambiador de Na+/H+) y la wortmanina (WORT, un inhibidor de PI3K) se usan comúnmente para inhibir la macropinocitosis33,34. Encontramos que EIPA y WORT redujeron la macropinocitosis inducida por βγ-CAT en células epiteliales UB de sapo y células MDCK de mamíferos (Fig. 3g, h). Además, βγ-CAT estimuló la fosforilación de Akt y PI3K y la expresión de Rac123 en células MDCK (Fig. 3i). Tomados en conjunto, estos resultados demostraron que βγ-CAT, un complejo secretado endógenamente de una PFP y una TFF, estimula y participa en la macropinocitosis en diversas células de B. maxima así como en varias células de mamíferos.

Las AQP y el flujo de iones están involucrados en el transporte de agua y la regulación del volumen de las células UB de sapo bajo estimulación por múltiples hormonas35,36,37. La internalización por macropinocitosis no es selectiva, mientras que las células epiteliales de transición son polares. Por lo tanto, evaluamos la relación entre la macropinocitosis estimulada por βγ-CAT y BmAQP2. Observamos que la ubicación de βγ-CAT y BmAQP2 en las células epiteliales de UB de sapo difería entre las soluciones de Ringer isotónicas, hipertónicas e 'hipertónicas / isotónicas' (hipertónicas seguidas de volver a isotónicas) (Fig. 4a). Cuando los sapos se expusieron a la solución de Ringer isotónica, βγ-CAT y BmAQP2 se ubicaron juntos y se distribuyeron en los lados apical y basal del epitelio de transición en la UB de sapo. En solución de Ringer hipertónica, βγ-CAT y BmAQP2 cambiaron su ubicación a los lados basales o laterales del epitelio de transición UB. Por el contrario, cuando los sapos se devolvieron a la solución de Ringer isotónica desde la solución de Ringer hipertónica, βγ-CAT y BmAQP2 comenzaron a migrar hacia el lado apical del epitelio de transición. Esta observación sugiere que la macropinocitosis inducida por βγ-CAT está involucrada en la internalización y transporte de BmAQP2 en la UB. En MDCK, también se observó colocalización intracelular de βγ-CAT y AQP2 (Fig. 4b). Estos resultados indicaron que la macropinocitosis estimulada por βγ-CAT desempeña un papel en la regulación de las AQP en diversas condiciones osmóticas, lo que revela otro aspecto de esta proteína en la modulación del equilibrio hídrico del sapo.

a Colocalización de βγ-CAT y BmAQP2 en el tejido UB de sapo B. maxima después de colocar los sapos en solución de Ringer isotónica, hipertónica o hipertónica/isotónica durante 3 horas, según se analizó mediante inmunohistofluorescencia. Barras de escala, 25 μm. b Colocalización intracelular de βγ-CAT y AQP2 en células MDCK con o sin el tratamiento de βγ-CAT 10 nM durante 15 minutos según lo determinado por inmunofluorescencia. Barras de escala, 30 μm. Todos los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes.

La secreción de exosomas es un aspecto importante de la exocitosis celular que puede verse como un medio de transporte selectivo de materiales entre las células y un modo de comunicación intercelular38. Debido a que βγ-CAT promueve la macropinocitosis, exploramos más a fondo el destino celular y el papel de las vesículas que contienen βγ-CAT. Se detectó βγ-CAT tanto en cuerpos multivesiculares (MVB) como en vesículas intraluminales (ILV) de células epiteliales UB (Fig. 5a). Teniendo en cuenta que el 98% de las células epiteliales UB de sapo sobrevivieron 3 horas de cultivo in vitro a temperatura ambiente (Fig. 4a complementaria), se recolectaron y observaron los exosomas secretados por estas células (Fig. 5b), que contenían marcadores de exosomas típicos CD63, TSG101 y flotillina -1, y el número de exosomas aumentó cuando estas células se trataron con βγ-CAT purificada (Fig. 5c). El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) reveló que el inmunoagotamiento de βγ-CAT endógeno atenuó la liberación de exosomas de las células epiteliales UB de sapo y las células peritoneales (Fig. 5d y Fig. 4b complementaria), mientras que la adición de βγ-CAT aumentó sustancialmente la liberación de exosomas de estas células. (Fig. 5e y Fig. 4c complementaria). Ninguno de estos tratamientos cambió el diámetro medio del exosoma. También se obtuvieron resultados similares en células MDCK y T24 de mamíferos (Figura complementaria 4d, e). En conjunto, estos resultados mostraron que βγ-CAT promueve la producción y liberación de exosomas tanto en células de sapo como de mamífero.

a Localización ultraestructural de βγ-CAT en tejido UB de sapo por IEM. βγ-CAT (flecha) se detectó fácilmente en MVB (asterisco) o ILV. Vehículo (control IgG de conejo). b Análisis TEM de exosomas del sobrenadante de células epiteliales UB de sapo cultivadas in vitro durante 3 horas. c Análisis de transferencia Western de moléculas de flotillina-1, TSG101 y CD63 en exosomas aislados del sobrenadante de células epiteliales UB de sapo cultivadas in vitro durante 3 horas con o sin la adición de βγ-CAT 50 nM. d, e Análisis de la concentración y tamaño de partícula (30–200 nm) de exosomas de células epiteliales UB de sapo con y sin 50 μg mL-1 de anticuerpos anti-βγ-CAT (d) o la adición de 50 nM βγ-CAT ( e) por la ANT. f, g El porcentaje (f) y la intensidad de fluorescencia media (g) de exosomas que contienen dextrano de células epiteliales UB de sapo en un medio de cultivo que contiene 1 mg mL−1 de dextrano marcado con FITC mediante citometría de nanoflujo con o sin la adición de 50 nM βγ-CAT. h Análisis de transferencia Western de βγ-CAT y BmAQP2 en exosomas de células epiteliales UB de sapo cultivadas in vitro durante 3 horas con o sin la adición de βγ-CAT 50 nM. i Determinación IEM de βγ-CAT y BmAQP2 en exosomas (asterisco) de células epiteliales UB de sapo. BmAQP2 y βγ-CAT se marcaron con partículas de oro coloidal de 10 nm (flecha) y 5 nm (triángulo), respectivamente. j, k Veces los cambios de las concentraciones de Na+ total (j) y media (k) en los exosomas del mismo número de células MDCK con o sin βγ-CAT 10 nM durante 3 horas. l Doble los cambios de las concentraciones totales de Na+ en los exosomas del mismo número de células MDCK en medio hipertónico con o sin βγ-CAT 10 nM durante 3 horas. Las barras representan la media ± SD de muestras por triplicado en d-g. Los datos representan la media ± SD de al menos tres réplicas independientes en j–l. ns (P ≥ 0.05), *P < 0.05 y ****P < 0.0001 por la prueba t no pareada. Todos los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes. Véase también la Fig. 4 complementaria.

Investigamos más a fondo las propiedades de los exosomas estimulados por βγ-CAT. La distribución de tamaño de los exosomas derivados de células epiteliales UB de sapo se determinó mediante citometría de flujo para el análisis de nanopartículas. Los diámetros de estos exosomas se concentraron principalmente en el rango de 50 a 150 nm (Fig. 4f complementaria). Cuando se incubó 1 mg mL-1 de FITC-dextrano con exosomas aislados, los exosomas no contenían FITC-dextrano (Fig. 4g complementaria). Por el contrario, cuando se agregó dextrano al cultivo de células epiteliales UB de sapo en las mismas condiciones, se identificó FITC-dextrano en los exosomas secretados por las células (Fig. 4g complementaria). Esta observación indicó que los exosomas aislados no absorbieron dextrano de 70 kDa, pero el dextrano fue absorbido por células epiteliales UB de sapo por macropinocitosis y liberado de las células en forma de exosomas. Curiosamente, la proporción de exosomas que contenían FITC-dextrano se mantuvo sin cambios en las células epiteliales UB de sapo con o sin la adición de βγ-CAT purificada (Fig. 5f), y no hubo diferencia en la intensidad de fluorescencia media de estos exosomas (Fig. 5g ). Estos resultados sugirieron que βγ-CAT promueve la exocitosis y facilita el transporte transcelular de sustancias extracelulares como el dextrano al aumentar la liberación de exosomas. Sin embargo, las propiedades aparentes de los exosomas liberados no parecen alteradas según lo analizado en la etapa actual.

Tanto BmAQP2 como oligómeros de βγ-CAT se detectaron mediante transferencia de Western en exosomas liberados de células epiteliales UB de sapo, lo que refleja la presencia de βγ-CAT endógeno. La adición de βγ-CAT a las células mejoró en gran medida la cantidad de oligómeros BmAQP2 y βγ-CAT detectados (Fig. 5h). IEM demostró la colocalización de BmAQP2 y βγ-CAT en exosomas individuales (Fig. 5i). Estas observaciones sugirieron que βγ-CAT impulsa el reciclaje extracelular y/o la comunicación intercelular de las AQP a través de la liberación de exosomas.

Además, analizamos el efecto de βγ-CAT sobre los niveles de Na+ en exosomas de células MDCK. No se observaron diferencias en las concentraciones totales de Na+ en los exosomas producidos por el mismo número de células tratadas con o sin βγ-CAT 10 nM (Fig. 5j). Sin embargo, βγ-CAT aumentó la liberación de exosomas de MDCK en 6,8 veces (Fig. 4d complementaria), por lo que se redujeron las concentraciones medias de Na+ de los exosomas (Fig. 5k). Además, se encontró un aumento en las concentraciones totales de Na+ en los exosomas inducidos por βγ-CAT en medios hipertónicos en las mismas condiciones (Fig. 5l).

Los anfibios viven tanto en la tierra como en el agua, y su piel está desnuda y actúa como un órgano importante en el equilibrio hídrico, la respiración (intercambio de gases) y la defensa inmunitaria1,3. Aunque inicialmente se identificó en las secreciones cutáneas de B. maxima 19, el complejo PFP βγ-CAT se expresa ampliamente en los órganos de equilibrio hídrico de B. maxima, incluidos la piel, la UB y el riñón (Fig. 1c-h, y Fig. 1c complementaria, 1d). Estudios previos indicaron la expresión de βγ-CAT en varios tejidos de B. maxima22,23. Curiosamente, en contraste con su potente citotoxicidad para varias células de mamíferos19,39, βγ-CAT solo muestra efectos tóxicos en células de sapo en una dosis de hasta 2 μM (Fig. 2b complementaria), que es mucho más alta que las concentraciones fisiológicas de βγ-CAT observadas22 . Su toxicidad para las células de los mamíferos podría reflejar la ausencia de mecanismos reguladores de esta proteína PFP exógena, que normalmente están presentes en el sapo18,21. Estas observaciones respaldan la noción de que el complejo PFP βγ-CAT no puede verse simplemente como un inductor de muerte celular y/o un microbicida, y además de sus funciones en la defensa inmunitaria22,23,24,25,26, la proteína exhibe otras funciones fisiológicas esenciales. funciones en este sapo.

La piel de B. maxima está cubierta con secreciones cutáneas que contienen varias moléculas biológicas que cumplen una variedad de funciones fisiológicas, incluidos péptidos similares a hormonas, péptidos antimicrobianos, af-PFP, TFF y albúmina que contiene hemo b16,40,41. De hecho, nuestros resultados revelaron que las secreciones de la piel son necesarias para prevenir la deshidratación (Fig. 1b). Además, demostramos que un componente importante de secreción de la piel, βγ-CAT, tiene un papel en la homeostasis del agua de sapo en los órganos osmorreguladores. Aunque la mayoría de los anfibios no viven en ambientes hipertónicos y su piel rara vez se ve afectada por la pérdida extrema de agua, el riñón y la UB están sujetos a una variedad de desafíos hipertónicos en condiciones fisiológicas como la formación y concentración de orina. De hecho, la expresión diferencial de βγ-CAT en UB con ambiente osmótico sugiere que βγ-CAT está involucrada en el cambio dinámico del transporte de agua de UB (Fig. 1e, f y Fig. 4a). Por lo tanto, demostramos además que βγ-CAT tiene un papel en la homeostasis del agua de sapo con células UB de sapo y células de riñón de mamífero. Este complejo PFP posee la capacidad de estimular y participar en la macropinocitosis (importación) y liberación (exportación) de exosomas por parte de células epiteliales de órganos osmorreguladores de sapo, lo que promueve el transporte de agua y Na+ involucrado en la homeostasis del agua. Debe enfatizarse que dado que B. maxima es una especie no modelo, actualmente es difícil explorar más a fondo los efectos fisiológicos de βγ-CAT a nivel animal por medio de la desactivación de genes.

Estudios previos con células de mamíferos y células peritoneales de sapo mostraron que βγ-CAT ejerce sus acciones biológicas por endocitosis y la formación de canales en los endolisosomas17,21,22,23,24, pero la vía endocítica de la proteína sigue siendo esquiva. La macropinocitosis, también conocida como bebida celular, es una forma de endocitosis que media la captación no selectiva de fluidos extracelulares y solutos6,12. En un modelo murino de DC, βγ-CAT aumenta la internalización de ovoalbúmina (antígeno), que se presume está mediada por macropinocitosis mejorada24. El presente estudio realizado en varias células derivadas de sapo, incluidas las células epiteliales de los órganos osmorreguladores y las células peritoneales, mostró claramente que βγ-CAT es capaz de inducir y participar en la macropinocitosis. Se ha demostrado que la macropinocitosis estimulada por βγ-CAT facilita la entrada de agua y Na+ en las células según se analizó en células epiteliales de órganos osmorreguladores de sapo (Fig. 2f y Fig. 3f). Esto puede explicar el papel de βγ-CAT en la promoción de la recuperación del volumen celular bajo estrés hipertónico (Fig. 2d-f). Dado que la IgG se une a los receptores IgG Fc ampliamente distribuidos para inducir la pinocitosis32, como la proteína FcRn del receptor de IgG similar al MHC de clase I, la presencia simultánea de IgG de conejo exógena no específica y βγ-CAT activa puede conducir a un aumento de la macropinocitosis. (Fig. 3b, cy Suplementario Fig. 3a, b). La macropinocitosis inducida por el factor de crecimiento está mediada por la activación de las vías de señalización Ras y PI3-quinasa11. De manera similar, la activación de la señalización de PI3-quinasa y Akt estuvo involucrada en la macropinocitosis estimulada por βγ-CAT, como lo sugieren los efectos de los inhibidores farmacológicos y el análisis de fosforilación de PI3K y Akt (Fig. 3g-i). Sin embargo, a diferencia de los factores de crecimiento clásicos, que se unen a los receptores de proteínas de membrana para iniciar su señalización, βγ-CAT se dirige a los gangliósidos y sulfátidos como receptores en balsas lipídicas para iniciar sus efectos celulares21. Las señales aguas abajo de estos componentes lipídicos y su relación con la inducción de macropinocitosis no están claras actualmente. En este sentido, deberían investigarse posibles diferencias entre la macropinocitosis estimulada por factores de crecimiento y la inducida por βγ-CAT.

Mientras engulle grandes volúmenes de líquido, la macropinocitosis también internaliza proteínas de la superficie celular como receptores e integrinas42,43. Se ha propuesto que la endocitosis estimulada por βγ-CAT desempeña un papel en la clasificación de elementos específicos de la membrana plasmática, como proteínas integradas funcionales o componentes lipídicos, que regulan las respuestas celulares a las variaciones ambientales17. Además, la internalización y el reciclaje de las AQP entre la membrana plasmática y el compartimento endosómico tienen funciones en el control de la captación y conservación de agua5,28. En consecuencia, se observó la colocalización de βγ-CAT con AQP en orgánulos endocíticos (Fig. 4), lo que sugiere que la macropinocitosis inducida por esta proteína PFP impulsa la endocitosis y el reciclaje de AQP. Claramente, la presencia de AQP en la membrana plasmática podría facilitar la pérdida de agua cuando las células se enfrentan a estrés osmótico hipertónico, por lo que la internalización de AQP inducida por βγ-CAT podría contrarrestar la deshidratación al prevenir la salida rápida de agua y la contracción celular.

La secreción de vesículas extracelulares que comprenden exosomas y microvesículas representa un nuevo modo de comunicación intercelular e intercambio de material38,44. Anteriormente, se descubrió que βγ-CAT aumenta la liberación de exosomas que contienen βγ-CAT de DC murinas, lo que activa la respuesta de células T de manera efectiva24. Debido a que βγ-CAT es un factor exógeno a las DC murinas, la explicación del fenómeno no es obvia. Sin embargo, la PFP es un elemento endógeno a las células de sapo. El presente estudio ilustró que la exocitosis celular en forma de liberación de exosomas de hecho aumentó en presencia de βγ-CAT, según lo determinado en diversas células derivadas de sapo (Fig. 5d, e y Fig. 4b, c complementarias), lo que revela que la mediación de la exocitosis celular a través de la liberación de exosomas es una propiedad intrínseca de esta proteína PFP. El FcRn expresado por muchas células, que puede promover la exocitosis y el reciclaje de IgG45. El efecto de exocitosis de βγ-CAT puede amplificarse aún más por exocitosis y circulación de IgG (Fig. 5d y Fig. 4b complementaria). Estudios previos demostraron que βγ-CAT neutraliza característicamente la acidificación de los orgánulos endocíticos que contienen esta proteína22,23,24. Este proceso celular puede resultar en la transformación de orgánulos endocíticos que contienen βγ-CAT en MVB que no se fusionan con los lisosomas para la degradación de los solutos contenidos. La presencia de dextrano extracelular como un marcador de endocitosis inducido por βγ-CAT en exosomas que contienen βγ-CAT también respalda la vista anterior (Fig. 5f, g).

La observación de que βγ-CAT estimula y participa en la macropinocitosis y la liberación de exosomas implica fuertemente que esta PFP está involucrada en el transporte transcelular de sustancias extracelulares internalizadas mediante la importación y exportación celular impulsada por PFP en formas vesiculares a través de vías endolisosomales. Esta propiedad es particularmente importante in vivo, donde βγ-CAT podría transportar sustancias externas como agua y Na+ a ambientes internos de tejidos de sapo sin alterar las uniones estrechas celulares que mantienen las funciones de barrera epitelial. Curiosamente, se identificaron AQP en exosomas liberados en presencia de βγ-CAT (Fig. 5h, i), lo que sugiere que βγ-CAT modula la homeostasis del agua al impulsar el reciclaje extracelular y/o la comunicación intercelular de estos canales de agua. Alternativamente, la exocitosis mediada por βγ-CAT podría funcionar como un medio para la expulsión de solutos nocivos e indigestos contenidos en el líquido macropinocitado por las células para la adquisición de agua, como la expulsión de dextrano de las células epiteliales UB de sapo (Fig. 5f, g). El papel de βγ-CAT en la expulsión de sustancias nocivas absorbidas por macropinocitosis a través de la inducción de exocitosis y el mecanismo de clasificación celular involucrado son importantes desafíos futuros.

Nuestro estudio no descarta la posible implicación de otros mecanismos fisiológicos de transporte de agua, como las AQP y los canales iónicos. De hecho, nuestros hallazgos respaldan la posibilidad de que βγ-CAT pueda desempeñar un papel importante en el sapo B. maxima al participar en la regulación de los mecanismos clásicos de transporte de agua, especialmente ante el estrés osmótico. En general, se entiende que las proteínas clásicas integradas en la membrana, como las AQP y los canales iónicos, desempeñan un papel fundamental en el transporte de agua y la homeostasis28,46. Además, la proteína de unión estrecha claudina-2 media la permeabilidad a los movimientos de agua transepiteliales bajo gradientes osmóticos o de Na+ a través de la vía paracelular47,48. El presente estudio ha introducido un nuevo jugador, una proteína SELC βγ-CAT, en la red de transporte de agua y homeostasis a través de la modulación de la importación y exportación de material celular a través de vías endolisosomales. Se propuso un modelo de trabajo celular de la PFP βγ-CAT para promover la absorción y el mantenimiento del agua en el sapo B. maxima (Fig. 6). En este modelo, el agua y el Na+ pueden ser importados por macropinocitosis inducida por la PFP βγ-CAT. Mientras tanto, el canal transmembrana formado por βγ-CAT puede mediar en el flujo de Na+ (Fig. 2b, c). Estudios previos han demostrado que el canal formado por βγ-CAT puede causar flujo de iones catiónicos39. El complejo PFP se dirige a la envoltura viral para formar poros que inducen la salida de iones de potasio y calcio26. Inesperadamente, las concentraciones promedio de Na+ de los exosomas que contenían βγ-CAT fueron sustancialmente más bajas que las del control (Fig. 5j, k). Este fenómeno sugirió que la presencia de canales formados por βγ-CAT puede conducir a una salida rápida de Na+ fuera de los endolisosomas y/o exosomas. Por lo tanto, el Na+ se puede liberar al citosol a través de los canales βγ-CAT en los orgánulos endocíticos, lo que impulsa la liberación de agua al citosol a través de las AQP (Fig. 4). Esto es similar a la situación de los canales de dos poros que funcionan en los macrófagos de mamíferos42,43. La liberación mejorada de exosomas mediada por βγ-CAT puede promover la exportación de iones como Na+ (Fig. 5l) y/o agua a los espacios intercelulares debajo de las uniones estrechas, lo que favorece la absorción de agua en entornos celulares más profundos. Mientras tanto, los canales iónicos integrados en la membrana y las AQP en la membrana plasmática basal de las células epiteliales podrían mediar en la salida de Na+ y agua hacia los tejidos internos debajo de estas células logrando la absorción/reabsorción de agua en los tejidos internos del sapo5,49. Beber agua por macropinocitosis es energéticamente caro12. Sin embargo, la función de la PFP secretora βγ-CAT en la adquisición y el mantenimiento del agua es necesaria a la luz de las diversas condiciones osmóticas que el sapo B. maxima tiene que enfrentar a lo largo de su ciclo de vida.

βγ-CAT logró el transporte de vesículas intracelulares y el transporte transcelular de agua, Na+ y AQP2 al promover la macropinocitosis (importación) y la liberación de exosomas (exportación). Para una descripción detallada, consulte la prueba. Se simplifica la presentación de la capa de células epiteliales y el tejido interno. Todos los componentes de imágenes prediseñadas provienen de PowerPoint 2019 y Adobe Illustrator CC 2019.

Se han identificado PFP secretoras en organismos de todos los reinos de la vida14,15,16, y las af-PFP están ampliamente distribuidas en plantas y animales15,16,17. Con base en una gran cantidad de evidencia experimental sobre el complejo af-PFP y TFF βγ-CAT del sapo B. maxima18,19,20,21,22,23,24,25,26, hemos propuesto la hipótesis de la vía SELC mediada por por una PFP, que impulsa la importación y exportación de material celular a través de vías endolisosomales17. El presente estudio proporciona más evidencia funcional para apoyar nuestra hipótesis anterior. Regulada basándose en señales ambientales17,18, se ha demostrado que la proteína SELC βγ-CAT promueve la ingesta celular y el transporte de materiales ambientales, como antígenos, agua con iones y componentes de la membrana plasmática (consulte la referencia 24 y el presente estudio) basándose en distintos contextos celulares y que lo rodea, representando un sistema de administración vesicular de células hasta ahora desconocido. Estas capacidades plantean la posibilidad de que, además de trabajar en la presentación de antígenos y el mantenimiento del agua, βγ-CAT y/o sus homólogos puedan desempeñar un papel activo y fundamental en la adquisición de nutrientes celulares y la flexibilidad del metabolismo, como se propuso anteriormente17, que son temas intrigantes para futuras investigaciones. Estos PFP y las proteínas clásicas integradas en la membrana (como miembros de la familia de transportadores de solutos) pueden formar dos brazos celulares coordinados en la detección, muestreo y adquisición de nutrientes extracelulares. Obviamente, estos PFP que actúan como SELC deberían ser esenciales para las células en aquellos casos en los que los transportadores de soluto de membrana clásicos están bloqueados o incluso ausentes. Nuestros hallazgos servirán como pistas para descubrir nuevas estrategias celulares y las funciones fisiológicas de las PFP en la importación y exportación de materiales a través de sistemas endolisosomales entre células y entornos en organismos vivos, especialmente en mamíferos.

En conclusión, el trabajo actual aclaró un papel inesperado de una PFP secretora en el transporte de agua y la homeostasis. βγ-CAT, un complejo af-PFP y TFF, indujo y participó en la liberación de macropinocitosis y exosomas en células epiteliales de órganos osmorreguladores de B. maxima. Estos efectos podrían explicar el papel del complejo PFP en la promoción de la internalización, el transporte y la liberación de agua, Na+ y AQP, trabajando juntos en el mantenimiento de la regulación del volumen de células de sapo y la homeostasis del agua (Fig. 6). Junto con las AQP integradas en la membrana y los canales iónicos, la acción de la βγ-CAT secretora puede promover el logro general del mantenimiento y el equilibrio del agua, especialmente cuando el sapo enfrenta estrés osmótico hipertónico.

Se capturaron sapos (B. maxima) en la naturaleza y se criaron a temperatura ambiente alimentándolos con Tenebrio molitor vivo. Se utilizaron sapos con un peso promedio de 19 ± 5 g en experimentos después de ayunar en solución de Ringer isotónica durante 3 días. Todos los procedimientos y el cuidado y manejo de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Zoología de Kunming, Academia de Ciencias de China (ID de aprobación: IACUC-OE-2021-05-001).

La formulación de la solución de Ringer isotónica (NaCl 111,2 mM, KCl 1,9 mM, CaCl2 1,1 mM, NaHCO3 2,4 mM, MgCl2 1,6 mM) se modificó en base a un informe anterior50. Después del ayuno, los sapos del grupo hipertónico se colocaron en solución de Ringer hipertónica (solución de Ringer con NaCl 222,4 mM) durante 3 horas y se registraron sus cambios de peso. Los sapos del grupo hipertónico/isotónico se transfirieron luego de una solución de Ringer hipertónica a una solución de Ringer isotónica durante 3 horas y se registraron sus cambios de peso. Los cambios de peso de los sapos en solución isotónica de Ringer se registraron durante 6 horas como referencia, denominado grupo isotónico. Se estimuló eléctricamente la piel de algunos sapos (4,5 V CC, duración del pulso de 10 ms) durante 3 minutos para eliminar las secreciones de la piel, y los sapos se colocaron en una solución isotónica de Ringer durante 30 minutos. Luego se registraron sus tasas de supervivencia después de 48 horas en soluciones isotónicas e hipertónicas.

Las células epiteliales de sapo se obtuvieron por digestión de tejidos. Específicamente, se diseccionaron los tejidos UB, piel y riñón de B. maxima de cinco sapos cuya médula espinal había sido destruida. Los tejidos se enjuagaron adicionalmente y se extrajeron en solución de Ringer para eliminar la sangre residual, la mucosidad y otras impurezas. Luego se cortaron en pedazos y se lavaron dos veces en solución de Ringer, seguido de digestión oscilatoria con tripsina a temperatura ambiente durante 40 minutos. Las células se separaron con un tamiz de malla 200 en un tubo de centrífuga de 50 ml (Jet Biofil, Cat CFT011500). Además, se extrajeron células peritoneales de sapo del líquido peritoneal de B. maxima. Todas las células se enriquecieron por centrifugación a 2000 rpm durante 5 min a 4 °C. Las células digestivas de la piel de sapo y los tejidos UB contienen alrededor del 90 % y el 60 % de células epidérmicas, respectivamente, según lo analizado por citometría de flujo utilizando un anticuerpo monoclonal anti-pancitoqueratina AE1/AE3 (Invitrogen, Cat 53-9003-80).

Las líneas celulares de riñón canino Madin-Darby (MDCK), Caco-2, HEK293 y T24 se adquirieron de Kunming Cell Bank, Chinese Academy of Sciences. Las células se cultivaron en DMEM/F-12 (Biological Industries, Cat 01-172-1 A) que contenía suero fetal bovino al 10 % (Biological Industries, Cat 04-001-1 A) e inyección de cloruro de sodio y clorhidrato de levofloxacina al 1 %. Todas las líneas celulares se cultivaron y se hicieron crecer hasta la confluencia en matraces de cultivo de tejidos recubiertos con colágeno tipo I de cola de rata (Jet Biofil, Cat TCD010100) a 37 °C y 5 % de CO2 en atmósfera húmeda.

La purificación y el análisis de pureza de βγ-CAT se llevaron a cabo de acuerdo con la descripción anterior19,22.

El ensayo MTS se utilizó para detectar la citotoxicidad de βγ-CAT. En resumen, las líneas celulares MDCK y T24 se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 1 x 104 células por pocillo y se cultivaron durante la noche a 37 °C en CO2 al 5 %. Las células se incubaron con el reactivo MTS (Promega, Cat G3580) en la oscuridad durante 1 hora después del tratamiento con βγ-CAT a temperatura ambiente durante 2 horas. La absorbancia del sobrenadante del cultivo de células de sapo se midió con 2x106 células por pocillo. La absorción se detectó a 490 nm con el lector de microplacas Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suiza).

Se enriquecieron por centrifugación 2 x 107 células de piel de sapo, UB, riñón o peritoneo y luego se lavaron tres veces con 5 ml de solución de Ringer hasta que el sobrenadante no tuvo actividad hemolítica en eritrocitos humanos. La suspensión de células de sapo se resuspendió en cuatro grupos. El grupo de control no cultivado se centrifugó y se recogió el sobrenadante. Los otros tres grupos se incubaron a temperatura ambiente durante 1,5 horas y se centrifugaron para recoger el sobrenadante. Uno de ellos sirvió como grupo culto. Los dos lotes restantes se mezclaron con 50 μg mL-1 de anticuerpos de conejo o anticuerpos anti-βγ-CAT derivados de conejo, respectivamente, y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, mientras que los grupos sin cultivar y cultivados se trataron de manera similar usando el mismo volumen de Solución de Ringer. Se agregaron eritrocitos humanos al sobrenadante a una concentración del 3%, se incubaron durante 30 minutos a 37 °C y luego se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos. La absorción se detectó a 540 nm con el lector de microplacas Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Suiza).

Los métodos descritos anteriormente se modificaron según correspondiera51. Brevemente, las células MDCK, Caco-2 y T24 digeridas se cultivaron en medio sin suero durante 30 minutos a una concentración de 2 x 106 células por ml antes de la detección. Para determinar los diámetros de las células, tratamos células MDCK, Caco-2 y T24 con PBS hipertónico (la adición de NaCl a PBS 0,01 M aumentó la presión osmótica a 400 mOsm) que contenía βγ-CAT purificado en dosis de 10 nM, 10 nM y 5 nM, respectivamente. . Las células epiteliales de UB de sapo se incubaron con o sin HgCl2 0,3 mM durante 10 minutos a una concentración de 2 × 106 células por ml después de incubar con 50 μg mL-1 de anticuerpos anti-βγ-CAT derivados de conejo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se detectaron cambios de diámetro de células epiteliales UB de sapo en solución de Ringer isotónica o hipertónica. La concentración final de todas las células fue de 1x106 células por ml. El diámetro medio de las células se determinó mediante un contador de células automatizado Countstar (ALIT Life Science, Shanghái, China).

Las corrientes se registraron en celdas HEK293 con la configuración outside-out de la técnica patch-clamp a temperatura ambiente con un amplificador Multiclamp 700B y un convertidor analógico-digital Digidata 1550A controlado por un software pClamp10 (Molecular Devices, San Jose, EE. UU.). La solución de la pipeta contenía KCl 150 mM, HEPES 10 mM, EGTA 1 mM, pH 7,4; la solución del baño contenía NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4. La corriente de fondo (en blanco) y macroscópica inducida por βγ-CAT 100 nM se registraron con un protocolo de rampa de 500 milisegundos entre -100 mV y +100 mV cada 2 segundos desde un potencial de retención de 0 mV. Para los experimentos de reemplazo, la solución de la pipeta contenía NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, EGTA 1 mM, pH 7,4; la solución del baño contenía NaCl 150 mM o 15 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4. Todas las corrientes mostradas han sido restadas por fugas. Los datos se analizaron con pClamp10 y GraphPad Prism 8.

Los niveles de ARNm de βγ-CAT-α y βγ-CAT-β en piel de sapo, UB y riñón se detectaron mediante qRT-PCR utilizando un kit Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) (Yeasen, Cat 11201ES03). Los recuentos de ciclos de los genes diana se normalizaron con respecto a los de la β-actina. Los niveles de ARNm de FcRn en células de sapo de piel, UB, riñón y cavidad peritoneal también se detectaron mediante RT-PCR. Las secuencias de cebadores en este estudio se muestran en la Tabla complementaria 1.

Las reacciones de marcaje se realizaron de acuerdo con un procedimiento descrito previamente con algunas modificaciones52. La βγ-CAT purificada se dializó durante la noche en una solución reticulante (7,56 g de Na2CO3, 1,06 g de Na2CO3 y 7,36 g de NaCl disueltos en 1 L de agua; pH 9,0) utilizando una membrana de diálisis de 3500 Da (Biosharp, Cat BS-QT- 021), y se disolvió 1 mg de RBITC (Sigma, Cat 283924) en 1 mL de DMSO (Sigma, Cat D2650). La solución de RBITC se añadió lentamente a βγ-CAT para dar βγ-CAT: RBITC = 1 mg:150 μg y la muestra se incubó durante la noche a 4 °C, protegida de la luz. Se añadió NH4Cl (50 mM) y la solución se incubó a 4 °C durante 2 horas para terminar la reacción. Las muestras dializadas se concentraron a 1 mg mL−1 con PBS y se almacenaron a 4 °C en la oscuridad.

Se utilizaron los ajustes correspondientes sobre una descripción anterior53. Brevemente, las células MDCK se cultivaron hasta el 90 % en un portaobjetos de vidrio de 24 pocillos. Las secciones fijadas con paraformaldehído de muestras de tejido de sapo y los rastros de células se trataron con TritonX-100 al 0,5 %. Después de bloquear durante 2 horas en PBS que contenía BSA al 2 % a 37 °C, los tejidos y las células se incubaron con anticuerpos primarios anti-AQP2 de ratón (Santa Cruz, Cat sc-515798) o anti-βγ-CAT derivados de conejo para 2 horas a 37 °C. Las células se incubaron en la oscuridad con anticuerpo secundario marcado con fluorescencia durante 1 hora a 37 °C después de lavar con PBS tres veces. Las muestras se sellaron con un agente de extinción antifluorescente que contenía DAPI. La localización de βγ-CAT o BmAQP2 en tejidos de sapo se determinó mediante el uso de anticuerpos primarios anti-AQP2 de conejo (ImmunoWay, Cat YT0290) y anti-βγ-CAT derivados de ratón.

Las células MDCK se trataron con una dosis de RBITC-βγ-CAT 10 nM, en PBS 0,01 M con o sin 1 mg mL−1 de dextrano marcado con FITC (Sigma, Cat 46945) durante 15 minutos a 37 °C. Después de lavar con PBS tres veces, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 15 minutos y luego se trataron con TritonX-100 al 0,5 % durante 15 minutos. Las muestras se sellaron con un agente de extinción antifluorescente que contenía DAPI.

Las imágenes de la Fig. 4b fueron adquiridas por un sistema de microscopio láser confocal Nikon A1 (Nikon, Tokio, Japón). Las imágenes de la Fig. 1g, h, la Fig. 4a y la Fig. 3g complementaria se adquirieron con un sistema de microscopio Zeiss LSM 880 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).

El método para aislar exosomas se optimizó en base a una descripción previa24. Brevemente, las células MDCK y T24 se cultivaron hasta el 90 % en placas de cultivo celular de 100 mm. Las células se cultivaron en veinte placas de cultivo celular con y sin βγ-CAT 10 nM o 5 nM durante 3 horas a 37 °C. El sobrenadante celular (200 ml) se recogió para centrifugación en gradiente (300 × g durante 30 minutos; 500 × g durante 30 minutos; 2000 × g durante 30 minutos; 10 000 × g durante 40 minutos) a 4 °C para eliminar las células residuales, los desechos y microvesículas. Los exosomas se obtuvieron por ultracentrifugación a 100 000 × g con rotor P100AT2 durante 2 horas a 4 °C, y luego se resuspendieron en PBS y se enriquecieron nuevamente en la ultracentrífuga preparativa CP100WX (HATACHI, Tokio, Japón). Los exosomas enriquecidos se almacenaron a -80 °C para experimentos de seguimiento.

Se utilizaron sapos sanos B. maxima para tomar tejido y triturarlo para obtener células. Se cultivaron 2 × 107 células obtenidas de tres sapos en 10 ml de solución de Ringer que contenía βγ-CAT 50 nM, 50 μg mL-1 de IgG de conejo o 50 μg mL-1 de anticuerpos anti-βγ-CAT derivados de conejo durante 3 horas a temperatura ambiente. temperatura. Los exosomas se extrajeron con el kit de aislamiento de exosomas Hieff Quick (Yeasen, Cat 41201-A). El sobrenadante celular se obtuvo mediante una serie de centrifugaciones en gradiente (500 × g durante 10 minutos; 3000 × g durante 10 minutos). Se mezcló completamente con un cuarto de volumen del reactivo a 4 °C durante 2 horas y luego se centrifugó a 10 000 × g durante 1 hora para recolectar los exosomas. Después de la resuspensión en solución de Ringer, el líquido que contenía los exosomas se centrifugó a 100 000 × g con un rotor P100AT2 durante 2 horas a 4 °C y se repitió una vez en una ultracentrífuga preparativa CP100WX (HATACHI, Tokio, Japón). Los exosomas enriquecidos se almacenaron a -80 °C para experimentos de seguimiento.

Se incubaron 2x105 células MDCK y T24 con 100 μg mL−1 de dextrano marcado con FITC de 70 kDa (Sigma, Cat 46945) o Lucifer Yellow (Sigma, Cat L0144) en la oscuridad a 37 °C durante 30 minutos con y sin 10 βγ-CAT nM o 5 nM, respectivamente. Las muestras fueron seguidas por detección de fluorescencia de FITC o AmCyan. En cada muestra, se analizaron 1x104 células individuales. Se trataron 2 x 106 células epiteliales UB de sapo y células peritoneales con βγ-CAT 50 nM, mientras que se usó βγ-CAT 100 nM para 2 x 106 células de riñón y piel de sapo. En la prueba de inmunodepleción de βγ-CAT endógena, se incubaron células de sapo con 50 μg mL−1 de anticuerpos anti-βγ-CAT derivados de conejo durante 30 minutos antes de llevar a cabo el protocolo anterior. Para probar el efecto no específico de la IgG de conejo exógena, las células MDCK se incubaron con 50 μg mL-1 de IgG de conejo o anticuerpo anti-βγ-CAT derivado de conejo durante 30 minutos antes del protocolo anterior. Durante el experimento del inhibidor, las células se incubaron primero con EIPA 100 μM (MedChemExpress, Cat HY-101840A) o wortmannin 20 μM (Sigma, Cat 681675) durante 1 hora a 37 °C. Además, se cultivaron in vitro 2x106 células epiteliales de UB de sapo digeridas durante 3 horas y se coincubaron con 500 ng mL−1 de yoduro de propidio (BD Pharmingen, Cat 556547) durante 10 minutos a temperatura ambiente. La fluorescencia se registró utilizando el analizador de células LSR Fortessa (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.). Los datos fueron analizados por FlowJo 10 y GraphPad Prism 8.

Los exosomas de las células epiteliales UB de sapo se aislaron como se describe en "Aislamiento de exosomas". Se cultivaron exosomas o 2x107 células epiteliales de UB de sapo en medio que contenía 1 mg ml-1 de dextrano marcado con FITC con o sin βγ-CAT 50 nM a temperatura ambiente durante 3 horas. Los exosomas de las células epiteliales UB de sapo se enriquecieron y el dextrano residual se lavó utilizando el método descrito en "Aislamiento de exosomas". Todos los experimentos se realizaron en la oscuridad. La fluorescencia y la distribución del tamaño de las partículas se registraron utilizando Flow NanoAnalyzer (NanoFCM, Xiamen, China). Los datos fueron analizados por FlowJo 10 y GraphPad Prism 8.

Los experimentos se basaron en el informe anterior54. Las muestras de tejido se fijaron durante la noche con PB 0,1 M (pH 7,4) que contenía paraformaldehído al 3 %, glutaraldehído al 0,1 % a 4 °C, se lavaron con PB 0,1 M cuatro veces durante 15 minutos y luego se lavaron con glicina 0,1 M en PB 0,1 M durante 30 minutos. a 4 °C. Después de la deshidratación en gradiente de etanol, la muestra se incrustó en resina blanca LR (Sigma, Cat L9774) y se polimerizó a 55 °C durante 24 horas. Se prepararon secciones ultrafinas de 100 nm utilizando un ultramicrótomo EM UC7 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y se cargaron en rejillas de Ni de malla 200 (EMCN, Cat BZ10262Na). Los exosomas enriquecidos se unieron directamente a rejillas de Ni durante 10 minutos antes del tratamiento experimental. Las muestras se lavaron con agua desionizada durante 2 minutos y luego se bloquearon con BSA al 1% durante 5 minutos. Después de la incubación durante la noche con anticuerpos primarios anti-βγ-CAT derivados de ratón o anti-AQP2 (ImmunoWay, Cat YT0290) derivados de conejo a 4 °C, las muestras se lavaron con agua desionizada 10 veces. Luego, las muestras se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con oro coloidal de 5 nm o 10 nm (Sigma, Cat G7527 y G7402) a temperatura ambiente durante 2 horas y se lavaron 10 veces a temperatura ambiente. Los exosomas se tiñeron con acetato de uranilo al 2 % durante 3 minutos y las secciones se tiñeron con acetato de uranilo al 2 % durante 7 minutos y citrato de plomo durante 5 minutos antes de la observación empleando un microscopio electrónico de transmisión JEM 1400 plus a 100 kV.

Se resuspendieron 2 x 107 células epiteliales de UB de sapo enriquecidas por centrifugación con solución de Ringer (se usó N-metil-D-glucamina en lugar de NaCl) después de la digestión y lavado 3 veces. Las células MDCK se cultivaron al 90 % en placas de cultivo celular de 100 mm, y en este experimento se usaron tres placas de cultivo celular en cada grupo. Se cultivaron células epiteliales UB de sapo y células MDCK durante 3 horas con y sin βγ-CAT 50 nM o 10 nM, respectivamente. Las células se recogieron y se lisaron con agua desionizada. Las concentraciones de sodio en los exosomas MDCK se midieron en ensayos isotónicos o hipertónicos utilizando cuarenta o veinte placas de cultivo celular en cada grupo, respectivamente. Los exosomas MDCK se aislaron como se describe en "Aislamiento de exosomas". Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido y luego se fundieron lentamente a temperatura ambiente y se repitieron dos veces. Se usó trituración de celda ultrasónica (potencia 200 W, trabajo cada 10 segundos durante 5 segundos, 40 ciclos) para liberar la muestra hasta que el líquido era transparente. Las impurezas de las muestras se eliminaron mediante centrifugación en gradiente (2000 × g durante 30 minutos; 10 000 × g durante 1 hora). Después de filtrar la muestra con un filtro de 0,22 μm, se determinó la concentración de iones de sodio en las muestras mediante un espectrómetro de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente iCAP6300 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Estados Unidos de América).

Todas las muestras de exosomas se diluyeron a alrededor de 1 × 107 partículas por ml con PBS. El tamaño de partícula y la concentración de exosomas se midieron con ZetaView PMX 110 (Particle Metrix, Meerbusch, Alemania), y los datos se analizaron con el software ZetaView 8.04.02.

Para medir el nivel de proteína de βγ-CAT o AQP2, se trataron células epiteliales UB de sapo, MDCK, Caco-2 y células T24 durante 15 minutos con o sin 50 nM, 10 nM, 10 nM y 5 nM de βγ-CAT, respectivamente. La Akt total y la fosfo-Akt se detectaron tratando células MDCK con o sin βγ-CAT 10 nM durante 30 minutos o 60 minutos. Los exosomas de células epiteliales UB de sapo se lavaron con solución de Ringer y se recogieron con tampón de lisis RIPA en hielo. El anti-βγ-CAT derivado de conejo, anti-AQP2 derivado de conejo (ImmunoWay, Cat YT0290), anti-CD63 derivado de ratón (Abcam, Cat ab193349), anti-TSG101 derivado de conejo (Proteintech, Cat 28283-1- AP), anti-flotillina 1 derivada de conejo (Proteintech, Cat 11571-1-AP), anti-PI3 Kinase p85 derivada de conejo (CST, Cat 4257), anti-fosfo-PI3 Kinase p85 derivada de conejo (CST, Cat 4228), anti-Rac1/2/3 derivado de conejo (CST, Cat 2465), anti-Akt total derivado de conejo (CST, Cat 4691) y anti-fosfo-Akt-S473 derivado de conejo (CST, Cat 4060) En estos experimentos se usaron anticuerpos primarios.

La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Máxima Verosimilitud basado en el modelo de corrección de Poisson55. Los árboles iniciales para la búsqueda heurística se obtuvieron automáticamente aplicando los algoritmos Neighbor-Join y BioNJ a una matriz de distancias por pares estimadas mediante un modelo JTT, y luego seleccionando la topología con un valor logarítmico de verosimilitud superior56. El análisis evolutivo se realizó en MEGA7. Además, Clustal Omega realizó un análisis de alineación de secuencias de AQP en sapo B. maxima y otras especies.

Los datos de supervivencia de los animales se analizaron mediante la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Todos los demás datos se analizaron utilizando la prueba t no pareada estándar. Las diferencias con valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativas. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism 8.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Las fuentes de todos los datos que respaldan los resultados de este estudio se citan en el texto principal, en las figuras complementarias y en la tabla 1 complementaria. 5 en la Información complementaria. Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio de Datos Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.0p2ngf226)57. Todos los componentes de imágenes prediseñadas en la Fig. 6 provienen de PowerPoint 2019 y Adobe Illustrator CC 2019.

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Zhang, Y., Zhao, Z., Shi, ZH y Ye, CJ Datos de: Una proteína formadora de poros impulsa la macropinocitosis para facilitar el mantenimiento del agua del sapo, Dryad, Dataset, https://doi.org/10.5061/dryad. 0p2ngf226 (2021).

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 31872226, U1602225 y 31572268) y el Programa de Becas Yunling para Yun Zhang. Nos gustaría agradecer al Centro Regional de Instrumentos de Diversidad Biológica de Kunming, Instituto de Zoología de Kunming, Academia de Ciencias de China por nuestra microscopía electrónica y agradeceríamos a Ying-Qi Guo por su ayuda para hacer muestras EM.

Estos autores contribuyeron por igual: Zhong Zhao, Zhi-Hong Shi.

Laboratorio clave de modelos animales y mecanismos de enfermedades humanas de la Academia de Ciencias de China/Laboratorio de ingeniería de péptidos de la Academia de Ciencias de China, Instituto de Zoología de Kunming, Academia de Ciencias de China, Kunming, Yunnan, 650201, China

Zhong Zhao, Zhi-Hong Shi, Chen-Jun Ye y Yun Zhang

Facultad de Ciencias de la Vida de Kunming, Universidad de la Academia de Ciencias de China, Kunming, Yunnan, 650204, China

Zhong Zhao y Zhi-Hong Shi

Instituto de Ciencias Médicas Básicas, Academia China de Ciencias Médicas y Facultad de Medicina de la Unión de Pekín, Pekín, 100005, China

zhong zhao

Centro de Excelencia en Evolución y Genética Animal, Academia de Ciencias de China, Kunming, Yunnan, 650201, China

yun zhang

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Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo: ZZ y ZHS Correspondencia a YZYZ, ZZ y ZHS concibieron y conceptualizaron el estudio; ZZ, ZHS y CJY realizaron los experimentos, ZZ, YZ, ZHS y CJY analizaron e interpretaron los datos; ZZ, YZ, ZHS escribieron el manuscrito; YZ, ZZ, ZHS y CJY revisaron críticamente el manuscrito en busca de contenido intelectual importante.

Correspondencia a Yun Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Luke R. Grinham. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Zhao, Z., Shi, ZH., Ye, CJ. et al. Una proteína formadora de poros impulsa la macropinocitosis para facilitar el mantenimiento del agua del sapo. Comun Biol 5, 730 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03686-1

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Recibido: 17 agosto 2021

Aceptado: 07 julio 2022

Publicado: 22 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03686-1

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