La pseudoiodinina de pirazolotriazina natural de Pseudomonas mosselii 923 inhibe los patógenos bacterianos y fúngicos de las plantas

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 734 (2023) Citar este artículo

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Los productos naturales producidos en gran parte por microorganismos del suelo similares a las Pseudomonas son una fuente constante de metabolitos antimicrobianos y pesticidas. Aquí informamos el aislamiento de la cepa 923 de Pseudomonas mosselii de los suelos de la rizosfera de arroz de los arrozales, que inhiben específicamente el crecimiento de las especies de patógenos bacterianos de plantas Xanthomonas y el patógeno fúngico Magnaporthe oryzae. El compuesto antimicrobiano se purifica e identifica como pseudoyodinina mediante espectros de masas de alta resolución, resonancia magnética nuclear y difracción de rayos X monocristalinos. La mutagénesis aleatoria de todo el genoma, el análisis del transcriptoma y los ensayos bioquímicos definen el grupo biosintético de pseudoyodinina como psdABCDEFG. Se propone que la biosíntesis de pseudoyodinina se inicie a partir del trifosfato de guanosina y la 1,6-didesmetiltoxoflavina es un intermediario biosintético. La mutagénesis del transposón indica que GacA es el regulador global. Además, dos pequeños ARN no codificantes, rsmY y rsmZ, regulan positivamente la transcripción de pseudoyodinina, y los reguladores de almacenamiento de carbono CsrA2 y CsrA3, que regulan negativamente la expresión de psdA. Se logra un aumento de 22,4 veces en la producción de pseudoyodinina optimizando los medios utilizados para la fermentación, sobreexpresando el operón biosintético y eliminando los sitios de unión de CsrA. Tanto la cepa 923 como la pseudoyodinina purificada in planta inhiben los patógenos sin afectar al huésped del arroz, lo que sugiere que la pseudoyodinina se puede utilizar para controlar las enfermedades de las plantas.

El arroz (Oryza sativa L.) es un cultivo básico de importancia mundial y es considerado como un cultivo estratégico para la seguridad alimentaria por la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO)1; desafortunadamente, la producción de arroz se ve obstaculizada por múltiples limitaciones, incluidas enfermedades devastadoras, como el tizón bacteriano de la hoja (BLB), la raya bacteriana de la hoja (BLS) y el añublo del arroz, que son provocados por Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), X. oryzae pv. oryzicola (Xoc), y Magnaporthe oryzae, respectivamente2,3. Actualmente, el cultivo de variedades de arroz con genes de resistencia a enfermedades (R) parece ser una mejor opción para controlar X. oryzae que otros esquemas de manejo2,4; sin embargo, los cultivares plantados en China suelen ser susceptibles a los patógenos5. Aunque los fungicidas y bactericidas químicos se usan con frecuencia para controlar las enfermedades del arroz6, su uso ha resultado en contaminación, resistencia a los medicamentos y resurgimiento de patógenos7,8. Un enfoque de control respetuoso con el medio ambiente es el uso potencial de bacterias antagónicas como agentes de biocontrol (BCA) que pueden suprimir patógenos mediante la producción de metabolitos secundarios bioactivos, incluidos antibióticos, sideróforos y compuestos volátiles9.

Los productos naturales (NP) son una fuente constante de metabolitos antimicrobianos y fármacos y son producidos en gran medida por microorganismos que habitan en el suelo10,11. Las especies de Pseudomonas son bacterias gramnegativas que persisten en el suelo, el agua, los animales y la rizosfera vegetal. Las pseudomonas producen muchas NP antimicrobianas, que incluyen fenazina, derivados de pirrol, 2,4-diacetilfloroglucinol (2,4-DAPG) y sustancias promotoras del crecimiento, lo que las hace bien adaptadas al estrés ambiental y adecuadas como BCA de patógenos de plantas12. Muchos metabolitos secundarios en Pseudomonas están regulados por el sistema de dos componentes GacS/GacA (TCS)13, pequeños ARN no codificantes (ARNs) y proteínas CsrA/RsmA14. Con el advenimiento de la secuenciación genómica, se han descubierto numerosos antimicrobianos en el microbioma global15 con beneficios para la agricultura moderna16 y la salud humana17. Sin embargo, el desarrollo continuo de patógenos resistentes a múltiples fármacos18 ha aumentado la urgencia de descubrir nuevas NP para controlar las enfermedades fúngicas y bacterianas de los cultivos.

Durante los últimos 40 años19, se han aislado y caracterizado miembros de la familia del heterociclo pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazina que se produce de forma natural, incluidos los fluviols20, la nostocina A21 y la pseudoiodinina22. La estructura de pseudoyodinina contiene un resto de 1,2,4-triazina fusionado con un anillo de pirazol y dos grupos metilo. Los derivados de la familia de las pirazolotriazinas muestran una amplia gama de funciones biológicas, incluidas actividades antitumorales, antivirales y antibacterianas23,24. En particular, la pseudoyodinina exhibió fuertes actividades antineoplúticas contra el sarcoma25. Curiosamente, la ruta biosintética y los grupos de genes biosintéticos (BGC) de pseudoyodinina no se han dilucidado y siguen siendo un recurso rico para la biología sintética y el desarrollo de derivados bioactivos.

En este trabajo, se examina la cepa 923 de P. mosselii para la inhibición de X. oryzae y M. oryzae, y el compuesto antagonista se identifica como pseudoyodinina. Se identifica el operón biosintético responsable del ensamblaje de pseudoyodinina. Se ha demostrado que el trifosfato de guanosina (GTP) es un precursor y la 1,6-didesmetiltoxoflavina (1,6-DDMT) es un intermedio biosintético de la pseudoyodinina. Se muestra que la regulación de la pseudoyodinina está mediada por GacA, rsmY/Z y CsrA123, lo que lleva a generar genéticamente una cepa superproductora de pseudoyodinina. Los resultados muestran que la pseudoyodinina es efectiva para controlar enfermedades bacterianas y fúngicas del arroz, ampliando así el rango de opciones potenciales para controlar los patógenos del arroz.

Está bien establecido que las plantas reclutan bacterias beneficiosas para suprimir patógenos en la rizósfera26. Por lo tanto, investigamos si las bacterias del suelo pueden suprimir el crecimiento de los patógenos del arroz Xoo PXO99A, Xoc RS105 y M. oryzae R01-1. Se obtuvo un total de 223 aislados bacterianos cultivables de 248 muestras de rizosfera que se recolectaron de 23 provincias de China; éstos fueron examinados para la actividad antagonista in vitro. Un aislado bacteriano llamado 923 mostró una fuerte actividad inhibidora contra Xoo PXO99A, Xoc RS105 y M. oryzae R01-1 (Fig. 1a, b), y la inhibición fue generalmente mayor para las cepas de Xoo que para Xoc (Fig. 1a, b complementaria) . Además, la cepa 923 mostró niveles variables de antagonismo hacia otros 11 patógenos Xanthomonas (Figura complementaria 1c).

a, b Actividad antagónica de la cepa 923 frente a Xoo PXO99A, Xoc RS105 y M. oryzae aislado R01-1 en ensayos de cultivo conjunto, la cepa 923 no tratada se utilizó como control (CK). c Longitudes de lesión de Xoc RS105-Gus en arroz Yuanfengzao inoculado con la cepa 923, ΔpsdA o 923 SUP a los 7 días posteriores a la inoculación (dpi) en el invernadero. 'Pre' representa hojas de arroz pretratadas con agua (MOCK-Pre), 923, ΔpsdA o 923 SUP (sobrenadante) antes de la inoculación del patógeno; 'Tre' representa hojas de arroz inoculadas con Xoc RS105-Gus y luego tratadas con agua (MOCK-Tre), 923, ΔpsdA o 923 SUP. d Dinámica poblacional de Xoc RS105-Gus en hojas de arroz. Las poblaciones bacterianas fueron monitoreadas por cuantificación GUS y tinción histoquímica a 7 dpi. Las barras de error muestran medias ± DE (n = 3 hojas independientes) y diferencias significativas en ***P < 0,001, ***P = 6,4 × 10−14, = 3,2 × 10−15, = 8,3 × 10−15, = 5,5 × 10−16 en secuencia de c, ***P < 0,001, ***P = 1,3 × 10−25, = 2,4 × 10−26, = 1,8 × 10-25, = 3,6 × 10-26 en secuencia de d, ns no significativa (P > 0.05). e, f Áreas de lesiones de la enfermedad en arroz cultivado en campo inoculado con la cepa 923 y (e) Xoo PXO99A o (f) Xoc RS105. Las áreas de lesión se determinaron a 15 dpi (n = 15 hojas independientes, medias ± DE), ***P < 0,001, ***P = 1,2×10−15, = 1,3×10−14 en secuencia de e; ***P < 0,001, ***P = 4,7 × 10−13, = 3,2 × 10−11 en secuencia de f; ns, no significativo (P > 0,05). La significación estadística de las áreas de lesión inoculadas con Xoc o Xoo se determinó utilizando el método de prueba LSD y ANOVA de una vía; La barra central representa la media, y se utilizó Min to Max de caja y bigotes. Los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente con resultados similares.

Para determinar si la cepa 923 inhibía el crecimiento de Xoo y Xoc en planta, se realizaron experimentos de biocontrol en invernadero. Cuando se aplicó la cepa 923 o el sobrenadante (SUP) como pretratamiento (Pre), las longitudes de las lesiones fueron aproximadamente un 50 % más pequeñas que el control (Fig. 1c), lo cual fue consistente con los resultados del ensayo GUS cuantitativo (Fig. 1d ). Además, tanto el tratamiento previo como el posterior con la cepa 923 dieron como resultado lesiones significativamente más pequeñas, causadas por Xoo y Xoc, respectivamente, en hojas de arroz en el campo (Fig. 1e, f). Estos resultados sugieren que la cepa 923 es un agente de control biológico (BCA) efectivo para patógenos bacterianos.

Se utilizaron múltiples enfoques para identificar la cepa 923. El análisis filogenético de las secuencias de ARNr 16S mostró que 923 era miembro del género Pseudomonas y se agrupaba con P. mosselii DSM17497, que era 99,6 % similar (Fig. 2b complementaria). Para confirmar aún más la clasificación taxonómica de la cepa 923, se secuenció todo el genoma (Fig. 2a complementaria). El análisis de identidad de nucleótido promedio (ANI) basado en la genómica indicó que el genoma 923 tenía un valor ANI del 99,25 % en comparación con P. mosselii DSM17497; esto es más alto que el valor umbral del 95% para la demarcación de especies, lo que confirma que la cepa 923 es P. mosselii. Ensayos filogenómicos adicionales respaldaron aún más estas conclusiones (Fig. 2c complementaria).

Las bacterias productoras de antibióticos generalmente producen zonas de inhibición cuando se las coloca en un medio cubierto con un patógeno objetivo27. Preparamos extractos de los cultivos de la cepa 923 con una variedad de solventes orgánicos y los colocamos en placas sembradas con Xoo PX099A. Los extractos de acetato de etilo produjeron las zonas de inhibición más grandes cuando se colocaron en la superposición Xoo PX099A (Fig. 3a complementaria). Además, el extracto de acetato de etilo se sometió a una columna de gel de sílice de fase inversa C18 para producir doce fracciones, etiquetadas como A1-A12. Según el perfil de bioactividad, las fracciones A1 y A5-A6 se purificaron adicionalmente mediante HPLC preparativa en una columna C18 para dar los compuestos PM-1 a PM-7 (Fig. 2a y Fig. 3a complementaria). Entre los siete compuestos purificados, solo PM-3 mostró una actividad inhibidora significativa para Xoo PX099A (Fig. 2b). Se determinó que la fórmula molecular de PM-3 era C6H7N5O mediante espectros de masas de alta resolución (HRMS) (m/z 166,0722 [M + H]+, calculado para C6H8N5O, 166,0729) (Fig. 4 complementaria). Los datos de resonancia magnética nuclear (RMN) (Figuras complementarias 5 a 8) y la difracción de rayos X de un solo cristal (Figura 2c y Tabla complementaria 1) confirmaron aún más la estructura de PM-3, que era idéntica a la pseudoyodinina. Además, PM-3 (pseudoyodinina) demostró eficacia contra muchas otras especies patógenas de Xanthomonas, incluida X. campestris pv. phaseoli, X. campestris pv. malvacearum y X. citri subsp. citri (Fig. 3d complementaria).

a Diagrama de flujo para la extracción y aislamiento de los compuestos de la cepa 923 que inhibieron PXO99A. Las abreviaturas y estructuras son las siguientes: PE, éter de petróleo; EtOAc, acetato de etilo; NBA, alcohol n-butílico; MeOH, metanol; compuestos: PM-1, C16H18N2O; PM-2, C15H16N2O; PM-3, C6H7N5O; PM-4, C15H16N2O2; PM-5, C5H5N5O; PM-6, C16H26O3; y PM-7, C18H30O3. b La actividad antibacteriana de los compuestos PM-1 a PM-7 para Xoo PXO99A; Se usó metanol como control negativo. c Dibujo de rayos X ORTEP para PM-3.

Los ensayos de MIC (concentración mínima inhibitoria) y EC50 (concentración efectiva para el 50 % de inhibición) mostraron que la pseudoyodinina era más tóxica para Xoo PX099A y Xoc RS105 que otras 11 Xanthomonas spp. con CIM de 0,5 y 4 μg/mL y valores de EC50 de 0,17 y 1,36 μg/mL, respectivamente (Figuras complementarias 9a, b y Tabla 1). La pseudoyodinina también inhibió el crecimiento de M. oryzae R01-1 con valores de MIC y EC50 de 8,25 y 4,43 μg/mL, respectivamente (Fig. 9c complementaria).

Estudios anteriores demostraron que el ácido fenazina-1-carboxílico (PCA; también conocido como Shenqinmycin) era un bactericida efectivo para el control de BLB y BLS en China28,29. Sorprendentemente, nuestros resultados muestran que los valores de MIC y EC50 de la pseudoyodinina fueron significativamente más bajos que los del PCA (Tabla 1), lo que respalda aún más el potencial de la pseudoyodinina como bioplaguicida ecológico.

Se examinó P. mosselii 923 y pseudoyodinine por su capacidad para inhibir los patógenos Xoc y Xoo y se demostró que reducen significativamente el área de lesión de las hojas de arroz a 15 ppp (Fig. 10a-c complementaria). Mientras tanto, la medición de la población bacteriana en las hojas de arroz indicó que los tratamientos Tre (tratamiento) o Pre redujeron significativamente la colonización por Xoo y Xoc a 14 y 21 ppp (Fig. 10b-d complementaria). Con el fin de identificar si la pseudoyodinina es suficiente para proteger las hojas de arroz de las lesiones, volvimos a probar la actividad de biocontrol del mutante ΔpsdA y WT de P. mosselii 923 en plántulas de arroz y plantas adultas. Las hojas inoculadas con el mutante de deleción ΔpsdA exhibieron longitudes de lesiones y la actividad GUS equivalente al tratamiento MOCK (Fig. 1c, d). Mientras tanto, probamos los efectos del mutante ΔpsdA, WT P. mosselii 923 y pseudoyodinine en la inhibición del crecimiento de Xoo en planta. Como se predijo, el mutante de deleción ΔpsdA indujo lesiones que eran similares en tamaño al tratamiento MOCK (Fig. 11 complementaria), lo que implica que solo la necesidad de pseudoyodinina contribuye a la protección de las plantas. La eficacia de la pseudoyodinina se analizó más a fondo aplicando concentraciones de 0 a 20 μM y evaluando la enfermedad en arroz cultivado en campo inoculado con Xoo PXO99A como tratamiento previo o posterior. La pseudoyodinina en concentraciones >5 μM causó una reducción significativa en el tamaño de la lesión (Fig. 3b, c complementarias), lo que indica que la pseudoyodinina inhibe efectivamente el crecimiento de Xoo PXO99A y Xoc RS105 en tejido de arroz. Curiosamente, observamos que la pseudoyodinina también redujo significativamente el área de lesión del añublo del arroz causado por el hongo M. oryzae R01-1 (Fig. 12 complementaria). Los datos anteriores demuestran que el compuesto es un bioplaguicida prometedor tanto para enfermedades bacterianas como fúngicas en el arroz.

Aunque la pseudoyodinina se identificó por primera vez en P. fluorescens var. pseudoiodinine22, los genes involucrados en su síntesis no fueron caracterizados. El genoma de P. mosselii 923 se analizó en busca de metabolitos secundarios utilizando el programa antiSMASH30 (https://antismash.secondarymetabolites.org/). Sin embargo, no estaba claro qué grupo estaba asociado con la biosíntesis de pseudoyodinina.

Para identificar genes en la vía de la pseudoyodinina, se usó el sistema de transposomas EZ-Tn5 para generar mutaciones aleatorias en P. mosselii 923. Aproximadamente 10 000 mutantes de la cepa 923 se seleccionaron para detectar actividad antimicrobiana hacia Xoo PXO99A, y el mutante 34-6 carecía de actividad antagónica in vitro (Fig. 3a). La ubicación de la inserción de Tn5 de copia única en el mutante 34-6 mapeada en gacA en el genoma (Fig. 3a); curiosamente, gacA codifica un regulador de respuesta que está altamente conservado en Pseudomonas spp. y pertenece a la familia de sistemas reguladores de dos componentes (TCS)13. Para confirmar aún más la función de gacA en la síntesis de pseudoyodinina, generamos un mutante knockout sin marcador en el que se eliminó el gacA completo de P. mosselii 923 mediante recombinación homóloga doble. La producción de pseudoyodinina se eliminó en el mutante resultante, que se denominó ΔgacA (Figuras complementarias 13b, c). La complementación del mutante ΔgacA con gacA en trans restauró la actividad antibacteriana y la producción de pseudoyodinina al nivel de tipo salvaje, pero la sobreproducción de gacA en trans no aumentó la producción de pseudoyodinina en la cepa 923 (Fig. 13a-c complementaria). Estos resultados sugieren que GacA regula la biosíntesis de pseudoyodinina, siendo consistente con el papel de GacA en la regulación de otros metabolitos secundarios en Pseudomonas13,31,32.

un mutante 34–6 de P. mosselii 923 carece de actividad antimicrobiana para Xoo PXO99A y contiene una inserción Tn5 en gacA. b Ensayos de actividad antibacteriana de mutantes P. mosselii 923, ΔpsdA, ΔpsdB, ΔpsdC, ΔpsdD, ΔpsdE, ΔpsdF y ΔpsdG y sus correspondientes cepas complementadas (CΔpsdA - CΔpsdG). c Análisis HPLC (Método B, detectado a 500 nm) de mutantes ΔpsdA, ΔpsdB, ΔpsdC, ΔpsdD, ΔpsdE, ΔpsdF y ΔpsdG. d Análisis HPLC (Método B, detectado a 500 nm) de mutantes complementados CΔpsdA - CΔpsdG. e Esquema del grupo de genes biosintéticos de pseudoyodinina en P. mosselii 923. Los números sobre los nombres de los genes indican la longitud del ORF. Los colores denotan las funciones de los genes de la siguiente manera: rojo, genes biosintéticos primarios; gris, genes biosintéticos adicionales. Las siete anotaciones de genes se muestran de la siguiente manera: psdA, metiltransferasa tipo 12; psdB, proteína de la superfamilia de la dioxigenasa resistente a la glioxilasa y la bleomicina; psdC, proteína factor modificador de sulfatasa; psdD, GTP ciclohidrolasa; psdE, proteína repetida WD-40; psdF, dominio metiltransferasa; psdG, proteína de biosíntesis de riboflavina RibD.

Para identificar aún más el grupo de genes biosintéticos responsable de la producción de pseudoyodinina, se compararon los transcriptomas de P. mosselii 923 (WT) y el mutante knockout (KO) ΔgacA. Este resultado reveló que 604 genes estaban regulados a la baja en el mutante gacA (Figura complementaria 13d, e); y 29 genes expresados ​​​​diferencialmente (DEG) estaban altamente regulados en el WT en comparación con el mutante KO (Figura complementaria 14 y Tabla complementaria 2). Para verificar los datos de RNA-seq, se seleccionaron al azar quince DEG para confirmación secundaria mediante análisis de RT-qPCR (Fig. 15 complementaria). Se clonaron diecinueve genes en el vector suicida p2P24Km y se enumeran en Datos complementarios 1 como p24-orf2059 - p24-orf2077. La eliminación de estos 19 genes resultó en mutantes de P. mosselii Δorf2059–Δorf2077 (Datos complementarios 1). Los 19 mutantes se examinaron en busca de actividad antimicrobiana y biosíntesis de pseudoyodinina, y siete mutantes (Δorf2064–Δorf2070) presentaban deficiencias en la producción de pseudoyodinina y actividad antimicrobiana defectuosa. Estos siete mutantes se renombraron de la siguiente manera: ΔpsdA (Δorf2064); ΔpsdB (Δorf2065); ΔpsdC, (Δorf2066); ΔpsdD (Δorf2067); ΔpsdE (Δorf2068); ΔpsdF (Δorf2069); y ΔpsdG (Δorf2070). Los siete genes que codifican la pseudoyodinina, a saber, psdA, psdB, psdC, psdD, psdE, psdF y psdG, se clonaron en el plásmido pBSPPc corriente abajo del promotor psdA, lo que dio como resultado pBS-psdA, pBS-psdB, pBS-psdC, pBS-psdD. , pBS-psdE, pBS-psdF y pBS-psdG, respectivamente. Estos clones se transformaron en los siete mutantes correspondientes para obtener las cepas complementadas correspondientes (CΔpsdA-CΔpsdG), que se rescataron para la actividad antibacteriana y la producción de pseudoyodinina (Fig. 3b-d).

RT-PCR confirmó que psdABCDEFG en el grupo de genes psd se originó a partir de un solo operón (Fig. 3e y Fig. 13f complementaria). Este grupo (psdABCDEFG) fue validado por expresión heteróloga en P. putida KT2440. El psdABCDEFG bajo el promotor nativo dota a P. putida KT2440 de la capacidad de producir pseudoyodinina, lo que demuestra que los siete genes son suficientes (Fig. 4a).

un grupo biosintético de pseudoyodinina en el constructo pBSPPc-ABCDEFG y análisis HPLC (Método B, detectado a 500 nm) de los extractos de fermentación de WT, KT2440 y cepa de expresión heteróloga manipulada y la muestra estándar (pseudoyodinina). Pseudoyodinina estándar aislada de P. mosselii 923; WT, P. mosselii de tipo salvaje 923; KT2440, P. putida; y KT2440/pBSPPc-ABCDEFG, P. putida que contiene el grupo de genes de pseudoyodinina en pBSPPc. b Vía propuesta para la biosíntesis de pseudoyodinina. 1: 2,5-diamino-6-(5-fosfo-d-ribosilamino)pirimidin-4(3H)-ona; 2: 5-amino-6-(5-fosfo-d-ribitilamino)uracilo; 3: 5-amino-6-d-ribitilaminouracilo; 1,6-DDMT: 1,6-didesmetiltoxoflavina.

Los resultados adicionales del análisis de homología mostraron que el grupo de genes psdABCDEFG se conservó en otras pseudomonas; especialmente en la cepa tipo P. mosselii DSM17497, que tiene una similitud de aminoácidos del 99% (Fig. 16 complementaria). Sin embargo, P. mosselii DSM17497 no produjo niveles detectables de pseudoyodinina y no inhibió Xoo PXO99A (Fig. 17a, b complementaria). Complementando el operón psd DSM17497 (orf2184-orf2190) en los mutantes ΔpsdB, ΔpsdC y ΔpsdG de P. mosselii 923, respectivamente, la actividad bacteriostática y la producción de pseudoyodinina se pueden restaurar al nivel 923 de tipo salvaje (Figura complementaria 17a, b). Además, los siete genes de orf2184-orf2190 se expresaron en P. mosselii DSM17497 (Fig. 17c complementaria), lo que indica que el grupo de genes de pseudoyodinina se transcribió en P. mosselii DSM17497. Los resultados anteriores indicaron que el grupo de genes psdABCDEFG era funcional en P. mosselii DSM17497, pero la falta de producción de pseudoyodinina justifica un estudio adicional.

El análisis BLAST mostró que las secuencias de aminoácidos de PsdD y PsdG tienen una similitud significativa con GTP ciclohidrolasa II y desaminasa, respectivamente, que están involucradas en la síntesis de riboflavina y toxoflavina33,34. Teniendo en cuenta la correlación entre las estructuras de pseudoyodinina y 1,6-didesmetiltoxoflavina (1,6-DDMT), presentamos una vía biosintética hipotética para pseudoyodinina basada en la similitud con la biosíntesis de toxoflavina33 (Fig. 4b). En la vía propuesta, PsdD y PsdG usan GTP para generar 2,5-diamino-6-(5-fosfo-d-ribosilamino) pirimidin-4(3H)-ona (estructura 1, Fig. 4b) y 5-amino- 6-(5-fosfo-d-ribitilamino)uracilo (estructura 2, Fig. 4b) en los dos primeros pasos. Luego, PsdE y/o PsdC median en la formación del enlace N-N al catalizar la conjugación de la estructura 2 o el producto desfosforilado 5-amino-6-d-ribitilaminouracilo (estructura 3, Fig. 4b) con glicina para generar 1 ,6-DDMT. Finalmente, el 1,6-DDMT se sometería a una secuencia de pasos de contracción y metilación del anillo para producir pseudoyodinina. Aunque no se observó 1,6-DDMT en P. mosselii 923 de tipo salvaje ni en cepas mutantes, la producción de pseudoyodinina se restauró cuando se alimentó con 1,6-DDMT a las cepas mutantes ΔpsdC y ΔpsdE (Fig. 18 complementaria), lo que demuestra que El 1,6-DDMT es un intermediario clave.

El GacS/GacA TCS controla la expresión de genes implicados en la biosíntesis de múltiples compuestos antimicrobianos y enzimas líticas35. En respuesta a los estímulos, GacS se autofosforila y activa el regulador de respuesta GacA por fosfotransferencia31. GacA activa la expresión de los ARNs rsmX, rsmY y rsmZ mediante la unión de una secuencia de activación aguas arriba (UAS) conservada TGTAAGNNATNNCTTACA32 que regula la expresión de los genes diana.

En P. mosselii 923, dos ARN pequeños no codificantes, rsmY y rsmZ, contenían el motivo de unión a GacA (5'TGTAAGCNAANGCTTACA3') en sus regiones promotoras (Fig. 19b, c complementarias). Para investigar la posible interacción de rsmY y rsmZ con GacA, este último se sobreprodujo en E. coli BL21 (DE3), se purificó y se demostró que se unía a las regiones promotoras de rsmY y rsmZ en ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) (Fig. 19a complementaria -C). Curiosamente, GacA no interactuó con el promotor psdA (datos no mostrados). Se construyeron deleciones en rsmY y rsmZ para investigar más a fondo sus funciones en la producción y actividad de pseudoyodinina. Los mutantes ΔrsmY y ΔrsmZ individuales no tuvieron efecto sobre la actividad antibacteriana; sin embargo, el doble mutante rsmYZ carecía casi por completo de actividad antibacteriana contra Xoo PXO99A (Fig. 5a). La actividad antibacteriana se restableció a los niveles de tipo salvaje en las tres cepas complementadas, a saber, CΔrsmY, CΔrsmZ y CΔrsmYZ (Fig. 5a). La producción de pseudoyodinina se redujo significativamente en el mutante ΔrsmY, pero no en el mutante ΔrsmZ. Como se predijo a partir de los ensayos antibacterianos, el doble mutante ΔrsmYZ no produjo pseudoyodinina. Las dos cepas complementadas (CΔrsmY y CΔrsmZ) se rescataron parcialmente para la producción de pseudoyodinina, mientras que la complementación simultánea con rsmY y rsmZ restauró la producción de pseudoyodinina a niveles de tipo salvaje (Fig. 5b, c). Estos datos indican que GacA regula positivamente la biosíntesis de pseudoyodinina al unirse directamente a los promotores rsmY y rsmZ, lo que activa la transcripción del operón en P. mosselii 923.

a Ensayos de actividad antibacteriana de mutantes P. mosselii 923, ΔrsmY, ΔrsmZ y ΔrsmYZ y mutantes complementados CΔrsmY, CΔrsmZ y CΔrsmYZ. Paneles b, d, perfiles de HPLC (Método B, detectado a 500 nm) de las cepas mutantes y complementadas en comparación con el 923 de tipo salvaje. Paneles c, e, producción de pseudoyodinina por diferentes cepas. Los números en los ejes y muestran rendimientos de pseudoyodinina. c Los mutantes de tipo salvaje 923, rsmY, rsmZ y rsmYZ y sus correspondientes cepas complementadas en medio LB. Las barras de error muestran medias ± DE (n = 3 réplicas biológicas independientes) y diferencias significativas en ***P < 0,001, ***P = 0,0002, = 2,5 × 10−14, = 1,5 × 10−10 en secuencia. e Rendimientos de pseudoyodinina en P. mosselii 923 de tipo salvaje en medio LB y TSB, los mutantes csrA1, csrA2, csrA3, csrA1A2, csrA1A3, csrA2A3 y csrA1A2A3, y cepas que sobreexpresan y RBS intercambiadas en medio TSB. Las barras de error muestran medias ± DE (n = 3 réplicas biológicas independientes) y diferencias significativas en ***P < 0,001, **P < 0,01, **P = 0,005, ***P = 4,5 × 10−10, = 1,1 × 10−9, = 9,3 × 10−17 en secuencia. ANOVA unidireccional seguido de prueba LSD. Los experimentos se realizaron tres veces de forma independiente con resultados similares. f Modelo propuesto de regulación mediada por GacA/CsrA de la biosíntesis de pseudoyodinina en P. mosselii 923. En la cepa 923, GacS/GacA TCS responde a señales no caracterizadas, y GacA activa la transcripción de dos ARN no codificantes (rsmY y rsmZ) al unirse a sus promotores, regulando así positivamente la producción de pseudoyodinina. Los dos homólogos de CsrA/RsmA, CsrA2 y CsrA3, inhiben el inicio de la síntesis de pseudoyodinina. CsrA2 y CsrA3 interactúan predominantemente con secuencias/bucles que contienen GGA en la región 5' no traducida de los ARNm de psdA; este sitio se superpone al RBS e interfiere con la traducción de la transcripción psdA. RsmY y RsmZ contienen múltiples sitios de unión de CsrA/RsmA dentro de los bucles de tallo predichos que compiten con los ARNm por la unión de CsrA2 y CsrA3, lo que antagoniza la supresión de la traducción.

RsmA (represor de metabolitos secundarios)36 y su homólogo CsrA (regulador de almacenamiento de carbono A)37 son proteínas de unión a ARN que interactúan con el motivo GGA no traducido 5' de los ARNm cerca del sitio de unión al ribosoma (RBS) de los genes diana, bloqueando así acceso al ribosoma38. Las proteínas CsrA/RsmA pueden ser secuestradas por ARN reguladores, lo que alivia la represión traduccional de los ARNm diana39. Investigamos si CsrA/RsmA contribuyó a la síntesis de pseudoyodinina en P. mosselii 923. Se usaron algoritmos BLAST para buscar ortólogos de CsrA/RsmA en el genoma de P. mosselii 923 y se identificaron tres genes homólogos, a saber, csrA1, csrA2 y csrA3. CsrA2 y CsrA3 mostraron más del 75% de similitud de aminoácidos, mientras que CsrA1 fue menos del 50% similar (Fig. 19d complementaria).

Se utilizaron mutagénesis por deleción y una fusión transcripcional psdA::uidA para investigar si CsrA1, CsrA2 y CsrA3 estaban implicados en la expresión de psdA. Analizamos la expresión de csrA1, csrA2 y csrA3 en el 923 de tipo salvaje y en los mutantes ΔcsrA1, ΔcsrA2 y ΔcsrA3 midiendo la actividad del promotor psdA. Los ensayos cuantitativos de GUS mostraron que la actividad de GUS impulsada por el promotor psdA fue dramáticamente mayor en los mutantes ΔcsrA1, ΔcsrA2 y ΔcsrA3 que en la cepa 923 de tipo salvaje (Fig. 19f complementaria). Estos resultados indicaron que la eliminación de csrA1, csrA2 y csrA3 aumentó la expresión de psdA, lo que sugiere que las proteínas CsrA reprimen la transcripción del operón de biosíntesis de pseudoyodinina. Para investigar más a fondo si se requerían CsrA1, CsrA2 y CsrA3 para mejorar la producción de pseudoyodinina, se construyeron mutantes de eliminación adicionales, a saber, ΔcsrA1A2, ΔcsrA1A3, ΔcsrA2A3 y ΔcsrA1A2A3. La producción de pseudoyodinina mejoró significativamente en los mutantes ΔcsrA2, ΔcsrA3, ΔcsrA1A2, ΔcsrA1A3, ΔcsrA2A3 y ΔcsrA1A2A3, pero no en la cepa mutante ΔcsrA1 (Fig. 5d, e), lo cual fue consistente con los ensayos antibacterianos contra Xoo PXO99A (Suplemento ario Fig. 19e). Estos resultados indican que CsrA1, CsrA2 y CsrA3 tienen un impacto negativo en la expresión de psdA y la producción de pseudoyodinina, y CsrA2 y CsrA3 funcionan como reguladores principales (Fig. 5e, f).

El operón psdABCDEFG se utilizó para construir la cepa modificada genéticamente P. mosselii ΔcsrA1A2A3-pBSPPc-P2064-RBS-Pseu-ORF, que se optimizó para una mayor producción de pseudoyodinina basada en el sistema regulador GacA-rsmY/Z-CsrA123. El cultivo de P. mosselii 923 en caldo de soja tríptica (TSB) dio como resultado un mayor crecimiento y niveles significativamente más altos de pseudoyodinina después de una fermentación de 36 h en comparación con el medio LB (Fig. 20a, b complementarias); por lo tanto, se eligió el medio TSB para otros experimentos. A continuación, se eliminaron los genes csrA1, csrA2 y csrA3 en la cepa 923, lo que dio lugar a 12,5 mg/L de pseudoyodinina frente a los 1,9 mg/L producidos por la cepa 923 de tipo salvaje (Fig. 5e). Luego, se introdujo el operón psdABCDEFG en el mutante ΔcsrA1A2A3 para obtener la cepa ΔcsrA1A2A3-pBSPPc-ABCDEFG (datos complementarios 1), lo que resultó en un aumento de 16,6 veces en la producción de pseudoyodinina en relación con la cepa 923 (Fig. 5e). Dado que la secuencia RBS del gen uidA 40 podría unirse y regularse negativamente por RsmA14, medimos la actividad GUS en los niveles transcripcional y postranscripcional en el 923 de tipo salvaje y el mutante ΔcsrA1A2A3. Los ensayos cuantitativos mostraron que la actividad de GUS a nivel transcripcional fue dramáticamente más alta que el nivel postranscripcional (Fig. 20c complementaria); esto indica que la unión al ribosoma en uidA fue mayor que la unión a psdA. Por lo tanto, el RBS del operón se editó para ser regulado negativamente por CsrA1, CsrA2 y CsrA3 mediante tecnología de clonación de un solo paso (Fig. 20d complementaria). Finalmente, el rendimiento de pseudoyodinina por la cepa modificada se incrementó a 42,5 mg/L, que fue más de 22,4 veces mayor que el P. mosselii 923 de tipo salvaje (1,9 mg/L) (Fig. 5e). Mientras tanto, comparamos la actividad antibacteriana y el crecimiento de las cepas WT y sobreproductoras, y los resultados indicaron que la sobreproducción de pseudoyodinina mejoró la actividad antibacteriana contra los patógenos Xoo PXO99A y Xoc RS105 (Fig. 21a-c complementaria); sin embargo, hubo una disminución en el crecimiento de P. mosselii en las 14 h iniciales de fermentación (Fig. 21d-f complementaria).

Los microorganismos beneficiosos abundan en los agroecosistemas y funcionan para controlar las enfermedades de las plantas y promover el crecimiento de las plantas26. El descubrimiento de microorganismos de biocontrol y el desarrollo de biopesticidas naturales es una forma eficaz de controlar las enfermedades de las plantas y mantener la seguridad agrícola mundial. En este estudio, informamos un BCA potencial de P. mosselii 923 con actividad antagonista específica para Xoo, Xoc y M. oryzae. La pseudoyodinina es el principal compuesto antagonista producido por P. mosselii 923, y el operón psdABCDEFG es suficiente para su producción.

Agentes de biocontrol producidos por Pseudomonas spp. se han utilizado para controlar enfermedades agrícolas, incluidas las fenazinas, los antibióticos lipopeptídicos y otros metabolitos secundarios41. Los derivados de la fenazina (p. ej., PCA y piocianina) se han utilizado para el control biológico de enfermedades fúngicas y se han estudiado en P. fluorescens 2–79, P. chlororaphis PCL1391 y P. aeruginosa 30–8442. P. mosselii se considera un patógeno humano oportunista distribuido en el suelo de la rizosfera que se sabe que inhibe patógenos e insectos43,44. Por ejemplo, el grupo de genes c-xtl involucrado en la biosíntesis de xantolisina se descubrió en P. mosselii BS011 e inhibió el desarrollo de M. oryzae45. Recientemente, una cepa de P. mosselii diseñada que expresa el gen ripAA suprimió de manera efectiva la marchitez bacteriana en el tabaco46. Además, una nueva proteína insecticida de P. mosselii denominada PIP-47Aa fue eficaz para controlar el gusano de la raíz del maíz47. En el presente estudio, mostramos que P. mosselii 923 de tipo salvaje tiene la capacidad de inhibir Xoo (PXO99A), Xoc (RS105) y M. oryzae (R01-1) (Fig. 1a, b). El compuesto antimicrobiano pseudoyodinina producido por P. mosselii 923 puede inhibir tanto Xoo (PXO99A) como Xoc (RS105) con valores de EC50 de 0,17 μg/mL y 1,36 μg/mL, respectivamente (Tabla 1). La pseudoyodinina también muestra una fuerte actividad fungicida contra M. oryzae con un EC50 de 4,43 μg/mL (Fig. 9c complementaria). Hasta donde sabemos, este es el primer informe que describe P. mosselii 923 y pseudoiodinine como antimicrobianos para el crecimiento de bacterias y hongos.

Hace cuarenta años, el compuesto antimicrobiano pseudoyodinina fue identificado como un producto de P. fluorescens var. pseudoyodinina22. La pseudoyodinina es un miembro de la familia de NPs19 pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazina. Aunque se ha informado sobre la síntesis química de pseudoyodinina19, el rendimiento es generalmente bajo y los costos altos, lo que limita la viabilidad de una fuente sintética. Curiosamente, la base genética de la biosíntesis de pseudoyodinina y el ensamblaje de la molécula no ha sido bien estudiada. En este estudio, se demostró que GacA regula positivamente la biosíntesis de pseudoyodinina (Fig. 3a y Fig. 13a-c complementaria). Estudios anteriores han demostrado que el GacS/GacA TCS conservado regula positivamente la expresión de múltiples vías antimicrobianas en Pseudomonas, incluidos grupos de genes en P. fluorescens48, P. chlororaphis49 y P. aureofaciens50. En el estudio actual, el mutante ΔgacA se vio afectado en la producción de pseudoyodinina en P. mosselii 923 (Fig. 13b, c complementaria), lo que nos llevó a investigar más a fondo la biosíntesis y regulación de pseudoyodinina.

Para identificar el BGC involucrado en la biosíntesis de pseudoyodinina, analizamos el genoma y el transcriptoma de P. mosselii en la cepa 923 y el mutante ΔgacA y encontramos que los genes que codifican GTP ciclohidrolasa y metiltransferasa estaban significativamente reprimidos en el mutante ΔgacA (Tabla complementaria 2). Se generaron mutaciones en varios genes regulados a la baja y se examinaron para biosíntesis de pseudoyodinina y actividad antibacteriana; esto resultó en la identificación del operón psdABCDEFG (Fig. 3e). psdA y psdF codifican metiltransferasas, psdB codifica un miembro de la superfamilia de dioxigenasa de proteína resistente a bleomicina glioxilasa, psdC codifica un factor modificador de sulfatasa, psdD codifica una ciclohidrolasa GTP y psdE codifica una proteína repetida WD-40. La eliminación de estos seis genes psd eliminó en gran medida la producción de pseudoyodinina y la complementación restauró la producción (Fig. 3c, d), lo que indica que psdABCDEF es necesario para la biosíntesis de pseudoyodinina. El mutante ΔpsdG solo se atenuó parcialmente en la actividad antibacteriana y la producción de pseudoyodinina (Fig. 3b, c). El análisis de secuencia de psdG indica que codifica una proteína RibD, que funciona en la biosíntesis de riboflavina. Está bien establecido que la riboflavina (vitamina B2) actúa como cofactor y molécula de señalización51, y la psdG puede tener un papel en la estabilidad estructural o funcional de la pseudoyodinina. La pseudoyodinina se produjo en P. putida KT2440 cuando el operón psdABCDEFG se expresó en trans (Fig. 4a), lo que confirma que el operón psdABCDEFG es suficiente para la biosíntesis de pseudoyodinina en Pseudomonas.

Las secuencias de aminoácidos predichas de PsdD y PsdG muestran una similitud significativa con los genes que codifican la biosíntesis de toxoflavina, lo que sugiere que la pseudoyodinina podría sintetizarse parcialmente a través de una vía biosintética compartida o similar a la toxoflavina33. Proponemos que esta reacción produce pseudoyodinina a través de una secuencia de pasos de contracción y metilación del anillo (Fig. 4b). El 1,6-DDMT se confirma como un intermedio biosintético de la pseudoyodinina cuando se alimentan con él las cepas mutantes ΔpsdC o ΔpsdE y se restablece la producción de pseudoyodinina (Fig. 18 complementaria). Sin embargo, no se detectó 1,6-DDMT ni en P. mosselii 923 de tipo salvaje ni en las cepas mutantes, que pensamos que se convertiría rápidamente en el siguiente intermedio. Cabe señalar que la formación de 1,6-DDMT mediada por PsdE y PsdC sigue sin estar clara y una vía detallada de contracción del anillo a la pseudoyodinina espera una mayor investigación.

Estudios previos han demostrado que GacA y CsrA/RsmA tienen funciones reguladoras opuestas en genes diana a nivel postranscripcional52,53. Nuestros resultados de EMSA demostraron que GacA se une a las regiones promotoras de dos ARN pequeños no codificantes, rsmY y rsmZ (Fig. 19b, c complementarias), y la transcripción activada por unión del grupo de genes sintéticos de pseudoyodinina. Otros estudios bioinformáticos indicaron que P. mosselii 923 contenía tres genes csrA homólogos, a saber, csrA1, csrA2 y csrA3 (Fig. 19d complementaria). Se usaron mutagénesis por deleción y fusiones uidA postranscripcionales para mostrar que CsrA1, CsrA2 y CsrA3 regulaban negativamente la expresión de psdA y la producción de pseudoyodinina (Fig. 5d, e y Fig. 19e, f complementaria). Curiosamente, un sitio GGA estaba presente en la región 5 'no traducida del psdA RBS, lo que sugirió que CsrA podría reprimir la expresión de psdA al unirse a la transcripción líder y bloquear el acceso al ribosoma (Fig. 5f). Se necesitan más experimentos para determinar cómo interactúa CsrA con el ARNm objetivo. Sin embargo, aún se ha descubierto el mecanismo por el cual la pseudoyodinina ejerce su actividad antimicrobiana, lo que justifica un mayor estudio. Este informe identifica aún más a GacA y CsrA como reguladores importantes de la biosíntesis de pseudoyodinina y amplía nuestra comprensión de la pseudoyodinina como antimicrobiano tanto para bacterias como para hongos.

Los microorganismos son la fuente de muchos metabolitos secundarios bioactivos, incluidos antibióticos, compuestos antitumorales y antivirales que pueden usarse en agricultura y medicina54. Sin embargo, las cepas de tipo salvaje aisladas de la naturaleza generalmente producen cantidades limitadas de metabolitos secundarios, lo que requiere estrategias para mejorar el rendimiento de metabolitos55. En el estudio actual, utilizamos un enfoque múltiple para mejorar el rendimiento de pseudoyodinina, incluida la ingeniería de una cepa que sobreexpresa, la eliminación de los genes reguladores negativos, la modificación del RBS y la optimización del medio de cultivo. Estos enfoques condujeron al desarrollo de una cepa modificada genéticamente que producía 22,4 veces más pseudoyodinina que el tipo salvaje con rendimientos promedio de 42,5 mg/L (Fig. 5e). Se necesitan más métodos para aumentar la productividad de la pseudoyodinina, incluida la fermentación a escala industrial. Otras estrategias para maximizar los rendimientos del producto incluyen la manipulación de promotores, la genómica, la ingeniería de proteínas, la metabolómica y el perfilado de metabolitos56,57, que se han utilizado para aumentar los rendimientos de PCA por la cepa PA120157 de P. aeruginosa.

Los pesticidas se usan ampliamente no solo en China sino también en el mundo para controlar las enfermedades de las plantas. Por ejemplo, la shenqinmicina (PCA) se ha utilizado para proteger los cultivos de arroz y hortalizas del tizón de la vaina del arroz, el tizón de la pimienta y el marchitamiento de las plántulas58. Nuestro estudio mostró que la pseudoyodinina puede prevenir BLB, BLS y el añublo del arroz causado por los patógenos Xoo, Xoc y M. oryzae sin afectar negativamente al arroz en el invernadero (Figuras complementarias 10–12); nuestros ensayos de campo muestran que la pseudoyodinina puede reducir significativamente las áreas de lesión de BLB con una eficiencia de control biológico de más del 50 % en concentraciones > 5 μM (Fig. 3b, c complementarias).

En el proceso de analizar otras pseudomonas para el grupo de genes psdABCDEFG, encontramos que estaba conservado; sin embargo, no existen homólogos del operón psd en P. fluorescens. en particular, la cepa tipo P. mosselii DSM17497 albergaba un grupo de genes de 6931 pb (orf2184, orf2185, orf2186, orf2187, orf2188, orf2189, orf2190) con un 99 % de similitud de aminoácidos con el operón de pseudoyodinina. Se observaron varias diferencias en los grupos de genes P. mosselii 923 y DSM17497 de la siguiente manera: (i) el aminoácido en la posición 39 en Orf2185 está mutado de Lys (K) a Asn (N) en DSM17497 (Fig. 16a complementaria); (ii) el residuo en la posición 89 en Orf2186 está mutado de Thr (T) a Ala (A) (Fig. 16b complementaria); y los residuos en las posiciones 158 y 208 en Orf2190 están mutados de Tyr (Y) a His (H) y Ser (S) a Val (V) (Fig. 16c complementaria), respectivamente.

Curiosamente, P. mosselii DSM17497 no produjo niveles detectables de pseudoyodinina y no inhibió Xoo PXO99A. Para investigar si el grupo psd de P. mosselii DSM17497 era funcional, generamos dos cepas replicadas, cada una de las mutantes ΔpsdB, ΔpsdC y ΔpsdG de P. mosselii 923 que contenían una copia introducida del operón psd DSM17497. Sorprendentemente, la actividad bacteriostática y la producción de pseudoyodinina se restauraron al nivel 923 de tipo salvaje en las cepas complementadas (Fig. 17a, b complementarias). Además, orf2184-orf2190 se expresaron en P. mosselii DSM17497 (Fig. 17c complementaria), lo que indica que el grupo de genes de pseudoyodinina se transcribió en P. mosselii DSM17497. Sigue siendo posible que existan inhibidores o represores en DSM17497 que supriman la síntesis o exportación de pseudoyodinina o sus precursores. La falta de producción de pseudoyodinina por parte de P. mosselii DSM17497 justifica una mayor investigación, que con suerte mejorará la eficacia de Pseudomonas como agente de biocontrol.

En resumen, nuestro estudio describe a P. mosselii 923 como un agente de control biológico y a la pseudoyodinina como un biopesticida verde potencial. El BGC de pseudoyodinina y la ruta biosintética predicha pueden alentar más estudios sobre la ingeniería de rutas y la producción a gran escala. Además, la red reguladora GacA-rsmY/Z-CsrA123 subyacente se puede implementar para diseñar mayores rendimientos de pseudoyodinina (Fig. 5f). Esto se necesita con urgencia ya que las enfermedades causadas por X. oryzae y M. oryzae continúan limitando los rendimientos del arroz y requieren métodos de intervención vigilantes.

Fitopatógenos Xanthomonas spp. se cultivaron en agar nutritivo (NA) a 28 °C59, y las cepas de E. coli DH5α y BL21(DE3) se cultivaron en medio Luria Bertani (LB)60 a 37 °C. Se utilizó caldo de soja tríptico (TSB; 30 g/L) para cultivar cepas de Pseudomonas a 30 °C. El hongo M. oryzae R01-1 se cultivó en medio avena (OAM)61 a 25 ˚C. Las cepas, plásmidos y cebadores utilizados en este estudio se enumeran en los Datos complementarios 1 y 2. Cuando fue necesario, se agregaron antibióticos en las siguientes concentraciones finales (µg mL−1): kanamicina (Km), 25; rifampicina (Rif), 75; gentamicina (Gm), 20; y espectinomicina (Sp), 25. Los reactivos químicos que incluyen éter de petróleo, acetato de etilo, alcohol n-butílico y metanol se adquirieron de Macklin (Shanghai, China). El ácido fenazina-1-carboxílico (PCA) fue proporcionado por el Dr. Yawen He (Escuela de Ciencias de la Vida y Biotecnología, Universidad Shang Hai Jiao Tong). Las enzimas de restricción se adquirieron de Takara Bio (Europa AB).

Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Bruker Avance III de 600 MHz (Alemania). Las muestras se disolvieron en metanol deuterado (CD3OD) o cloroformo deuterado (CDCl3). El análisis ESI-MS de los compuestos se llevó a cabo en un Agilent UPLC 1290 Infinity II/6545 Q-TOF (EE. UU.). Tanto la HPLC semipreparativa como la HPLC analítica se realizaron con una HPLC Agilent Technologies 1260 Infinity II con un detector DAD. Las columnas fueron las siguientes: columna Fisher Wharton C18 (250 × 10 mm, 5 μm, EE. UU.) (para HPLC semipreparativa) y columna Agilent C18 (150 × 4,6 mm 5 μm, EE. UU.) (para HPLC analítica). El 1,6-DDMT se adquirió de Princeton Biomolecular Research (Nº de catálogo PBMR 232664).

Para aislar bacterias con actividad antimicrobiana para Xoc RS105, se recolectaron muestras de suelo (n = 248) de la rizosfera5. Brevemente, 10 g de muestra se mezclaron uniformemente con 90 ml de agua esterilizada, luego esta suspensión se diluyó a diferentes gradientes con agua esterilizada. 100 μL de la solución anterior se sembraron en medio NA que contenía RS105. El antagonismo de las bacterias del suelo hacia Xoc, Xoo y otros patógenos se evaluó mediante el método de Kirby-Bauer (KB)62. Todas las cepas se probaron por triplicado y las zonas de inhibición frente a bacterias patógenas se midieron 2–3 días después del cultivo a 28 °C en NA y M. oryzae R01-1 se midieron 5 días después del cultivo a 25 °C en OAM.

El ARNr 16S de la cepa 923 se amplificó con los cebadores universales 27F y 1492R (Datos complementarios 2) con métodos establecidos5. El gen completo fue purificado y secuenciado por BioSune Biotech (Shanghai, China) y utilizado para búsquedas de Blast en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Las secuencias de ARNr 16S para 14 Pseudomonas spp. representativas. se obtuvieron de la base de datos NCBI, y se construyó un árbol filogenético basado en 16 S rRNA utilizando análisis de unión de vecinos con MEGA 7.063. Se utilizó una prueba de bootstrap con 1000 repeticiones para evaluar el nivel de confianza, y los entrenudos de las ramas representaron un porcentaje de confianza > 50%. El genoma completo de 923 se secuenció utilizando la plataforma de secuenciación Illumina Miseq PacBio en Personalbio (Shanghai, China). Los valores promedio de identidad de nucleótidos (ANI) se calcularon utilizando el servicio en línea J Species WS64. Para determinar la posición filogenética precisa de la cepa 923, todas las secuencias del genoma de Pseudomonas disponibles públicamente y las cepas relacionadas se recuperaron de la base de datos NCBI GenBank y se incluyeron en los análisis filogenéticos de acuerdo con Type Genome Server (TYGS) (https://tygs.dsmz. Delaware). La secuencia del genoma completo de la cepa 923 se depositó en la base de datos NCBI BioProject (BioProject ID: PRJNA826312).

La cepa 923 se cultivó en 50 mL de caldo LB a 30 °C con aireación a 220 rpm durante 12 h, luego se diluyó 1:100 en matraces de 2 L que contenían 300 mL de caldo LB y se incubó durante 24 h a 30 °C, 220 rpm. La fermentación se extrajo tres veces con igual volumen de éter de petróleo, acetato de etilo y alcohol n-butílico a temperatura ambiente, respectivamente. Las fases orgánica y acuosa se concentraron en un rotavapor, se secaron por congelación y se resuspendieron en 1 ml de metanol y agua estéril, respectivamente. Se extrajeron cincuenta microlitros de las cuatro muestras anteriores y se evaluó la actividad antibacteriana usando Xoo PX099A como se describió anteriormente5.

El extracto de acetato de etilo exhibió la mayor actividad antagonista contra Xoo PX099A. Se llevó a cabo una fermentación a gran escala y un lote de 10 L de la fermentación se extrajo adicionalmente con acetato de etilo. A continuación, el extracto crudo gelatinoso se cargó en una columna de gel de sílice de fase inversa C18 (MeOH/H2O, 3:7 a 9:1). Se obtuvieron doce fracciones de la columna y se purificaron más mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con una columna C18 (columna Agilent C18, 250 × 20 mm, 5 μm, EE. UU.) (método A). Usando este enfoque, siete compuestos fueron aislados y designados PM-1, PM-2, PM-3, PM-4, PM-5, PM-6 y PM-7. La actividad antagonista de cada compuesto se probó frente a PX099A después de la concentración con metanol como control.

Método de análisis y preparación de HPLC: Método A (preparación): La concentración inicial de metanol al 15 % se mantuvo durante 2 min y los gradientes de elución procedieron de la siguiente manera: gradiente lineal de metanol del 15 al 100 %, 2–18 min; metanol al 100 %, 18–22 min; 100 a 15 % de metanol, 22 a 26 min; y metanol al 15%, 26–30 min. El caudal fue de 5 ml/min con detector UV (longitud de onda: 210 y 500 nm). Método B (análisis): HPLC utilizando los disolventes A (agua) y B (metanol) con un caudal de 0,4 mL/min (columna Agilent C18, 150 × 4,6 mm 5 μm, EE. UU., 210 y 500 nm). La concentración inicial de metanol al 5 % se mantuvo durante 4 min, seguida de los siguientes gradientes: metanol del 5 al 20 %, 4-25 min; 20 a 100 % metanol, 25–26 min; Metanol al 100 %, 26–32 min, metanol al 100–5 %, 32–33 min y metanol al 5 %, 33–40 min.

Se determinó que la fórmula molecular de PM-3 era C6H7N5O mediante UPLC/Q-TOF-MS (m/z 166,0722 [M + H]+, calculado para C6H8N5O, 166,0729) con seis IHD (índice de deficiencia de hidrógeno). Los datos de RMN de 1H y 13C (Figuras complementarias 5, 6) mostraron la presencia de dos grupos metilo (δH 4.27, 4.44; δC 43.3, 57.7) y un protón aromático (δH 9.14). Debido a que hay demasiados átomos de nitrógeno y carbono cuaternarios en la molécula, fue difícil determinar aún más la estructura plana de PM-3. Afortunadamente, se generó un diminuto cristal en el solvente de metanol por evaporación del solvente después de muchos intentos. Finalmente, la estructura completa de PM-3 se determinó por difracción de rayos X (Fig. 2c) y era idéntica a la pseudoyodinina.

Se inocularon cultivos de semillas (500 μL) en 50 mL de LB o TSB en matraces de 250 mL. Para extraer y cuantificar la pseudoyodinina, se recolectó 1 mL de cultivo y se extrajo dos veces con volúmenes iguales de acetato de etilo. Posteriormente, la fase orgánica se recogió y se secó a 30 °C. y el residuo resultante se disolvió en 100 μL de metanol. Se recolectaron extractos crudos (5 μL) para análisis HPLC (Método B). La producción de pseudoyodinina se cuantificó utilizando el área del pico (A) en el eluato de HPLC de acuerdo con la siguiente fórmula: A = 776,86 pseudoyodinina (mM) + 52,234. La fórmula se derivó de una curva de calibración con pseudoyodinina purificada, que tenía un coeficiente de correlación (R2) de 0,999. El experimento se repitió tres veces de forma independiente.

Las cepas de P. mosselii se cultivaron en 3 mL de LB a 30 °C, 220 rpm durante 12 h. Las células recolectadas se suspendieron hasta una concentración final de OD600 = 2,0 utilizando medio TSB. Se prepararon diluciones en serie y se incubaron alícuotas de 100 μL en medio LB complementado con los antibióticos apropiados a 30 °C durante la noche. Para la curva de crecimiento, se prepararon 10 mL de cultivos de fermentación en matraces de 50 mL que contenían TSB como se describe anteriormente y se incubaron a 30 °C a 220 rpm. Se siguió el crecimiento de los cultivos mediante mediciones periódicas dentro de las 36 h mediante espectrofotometría a 600 nm (OD600). Este experimento se repitió tres veces de forma independiente.

Se sembraron 20 semillas del cultivar de arroz Yuanfengzao en macetas de plástico (16 × 12 cm), las cuales se mantuvieron en invernadero a 14 h luz (30 °C)/10 h oscuridad (28 °C) y 65% ​​HR. Las plántulas de arroz se utilizaron para ensayos de biocontrol después de 21 días de cultivo (etapa de 3 a 6 hojas). Las plantas de arroz en la etapa de tres hojas son adecuadas para los ensayos de control biológico Xoo y Xoc. Las plantas de arroz en la etapa de seis hojas son adecuadas para las inoculaciones por aspersión de Xoo y Xoc en el invernadero. Se prepararon con antelación suspensiones celulares de Xoc RS105 y Xoo PXO99A (OD600 = 0,6) y P. mosselii 923 (OD600 = 0,5). En resumen, estas cepas se cultivaron hasta la fase exponencial media, se centrifugaron y se lavaron dos veces con agua destilada estéril hasta una DO600 de 0,5–0,6. El sobrenadante del cultivo 923 (SUP) se preparó por centrifugación a 4 °C, 13 800 × g durante 10 min. Se prepararon soluciones madre de pseudoyodinina con valores de MIC de 4 µg/mL para Xoc RS105 y 0,5 µg/mL para PXO99A. Se utilizó agua destilada estéril (MOCK) como control.

Los ensayos de control biológico en plántulas de arroz en la etapa de tres hojas se inocularon mediante inyección con jeringa. Brevemente, las hojas de arroz de Yuanfengzao se inocularon con Xoc RS105-Gus (OD600 = 0,6) 3 h antes (Tre) y después (Pre) de la inoculación con agua, 923, ΔpsdA (OD600 = 0,5) o 923 SUP con jeringa sin aguja, luego se mantuvieron en el invernadero Las longitudes de las lesiones de la enfermedad se midieron a los 7 días. Las plantas de arroz Yuanfengzao en la etapa de seis hojas se rociaron con suspensiones de células bacterianas (2 ml de 1,0 × 108 ufc ml−1). Los tratamientos fueron los siguientes: (1) plantas de arroz inoculadas con las cepas RS105 o PXO99A; (2) arroz inoculado con patógenos RS105 o PXO99A y luego tratado con agua, cepa 923 (2 mL de suspensión) o pseudoyodinina (5 mL) como tratamientos Tre; (3) arroz inoculado con agua, cepa 923 (2 ml) o pseudoyodinina (5 ml) 12 h antes de la inoculación por aspersión con RS105 o PXO99A como tratamientos previos; y (4) controles inoculados con agua destilada estéril (MOCK). Se usó Tween-20 al 0,05% (v:v) (Sangon Biotech, Cat. No. A600560) en cada tratamiento. Las áreas de lesión de la enfermedad se midieron en las hojas (n = 20) a los 15 días y el crecimiento bacteriano se midió a los 7, 14 y 21 días después de la inoculación. Brevemente, se extirparon tres trozos de 4 cm de las puntas de las hojas con tijeras quirúrgicas estériles y se trataron con etanol al 75 % (30 s), hipoclorito de sodio al 3 % (3 min) y agua destilada estéril (1 min). Luego, el material de la hoja se maceró con un triturador de tejidos (JX-FSTPRP) a 55 Hz (dos veces durante 1 min) y luego se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 min. Se prepararon diluciones en serie y se incubaron en NA suplementado con los antibióticos apropiados a 28 °C durante 3–4 días hasta que se pudieron contar colonias individuales (>100/placa). Los experimentos de inoculación anteriores se repitieron tres veces de forma independiente.

Para los ensayos de control biológico en el campo, se sembró el cultivar de arroz Yuanfengzao en arrozales (1 × 2 m). En la prueba de campo, solo se eligieron para la medición las hojas bandera de las plantas de arroz en un método de muestreo de cinco puntos donde un punto incluye 10 plantas de arroz y una hoja bandera/por planta. Se evaluaron un total de 50 hojas por cada tratamiento. La gravedad de la enfermedad de BLS y BLB se investigó de acuerdo con el área de la lesión en las hojas (n = 15) a los 15 días después de la inoculación. Los experimentos de campo se repitieron tres veces de forma independiente.

Arroz cv. CO39 (Oryza sativa L. subsp. indica) es altamente susceptible a M. oryzae y fue elegido para estudios de infección. Se produjeron suspensiones de conidios a una concentración final de 1 × 105 conidios ml−1 inundando placas de cultivo de M. oryzae de 10 días de edad con agua destilada estéril que contenía Tween-20 al 0,05 % (v:v) como se indicó anteriormente. A continuación, la suspensión se inoculó por pulverización en plantas de 2 semanas de edad. Se roció pseudoyodinina sobre la superficie de las hojas de arroz a una concentración de 40 μM a las 24 h antes (Pre) y después (Tre) de la inoculación con la espora M. oryzae R01-1. Las plantas se colocaron en cajas de almacenamiento durante 24 h para mantener una alta humedad con un fotoperíodo de luz/oscuridad de 14:10 h a 25 °C y 90 % de HR. La gravedad de la enfermedad se registró a 7 ppp mediante imágenes. El área relativa de las lesiones se calculó con Adobe Photoshop CS5. El experimento se repitió tres veces de forma independiente.

Nuestra investigación anterior demostró que los sistemas de vectores derivados de pHM1, incluido pHG1, eran eficientes, estables y adecuados para el análisis de expresión génica en cepas de X. oryzae y para el seguimiento de infecciones en hojas de arroz40. Investigaciones anteriores con vectores pHM1 indicaron que la intensidad de la tinción de GUS en hojas de arroz se correlacionaba con la multiplicación bacteriana; por lo tanto, la actividad GUS de las cepas marcadas con Xoc RS105-Gus en los tejidos de arroz se analizó siguiendo nuestros protocolos anteriores65. El método detallado se describió en los métodos complementarios. Cada tratamiento se replicó en tres hojas y se realizaron tres experimentos independientes.

La actividad de GUS en cepas de P. mosseii se evaluó utilizando un protocolo modificado. Brevemente, P. mosselii 923 y mutantes se cultivaron en LB que contenía espectinomicina a 30 °C durante la noche. Las células bacterianas se recogieron en tubos de microcentrífuga de 2 ml (tres réplicas), se lavaron dos veces con 1 ml de agua estéril y se ajustaron a una DO600 de 0,5. Se realizaron análisis GUS cualitativos y cuantitativos de P. mosselii 923 y mutantes como se describe en los métodos complementarios.

Los sitios de clonación múltiple (MCS) en el vector de sonda promotora pNG1 se colocaron aguas arriba de uidA, y el sitio NdeI se superpuso con el sitio de inicio de la traducción (ATG). Por lo tanto, creamos fusiones de sonda y promotor uidA a nivel transcripcional y postranscripcional. La región del promotor psdA se clonó en pNG1 como un fragmento EcoRI/KpnI para crear pNG1-P2064 con la fusión promotor psdA-uidA (Datos complementarios 1). Usando un enfoque similar, el promotor psdA se clonó en pNG1 como un fragmento EcoRI/NdeI, lo que resultó en una fusión traduccional con uidA; la construcción resultante se denominó pNG1-P2064-post (Datos complementarios 1).

La mutagénesis de la cepa 923 de P. mosselii con EZ-Tn5 y la caracterización de los sitios de inserción se realizaron utilizando protocolos establecidos5. Brevemente, se sometió a electroporación 1 μl de EZTn5 del kit EZ-Tn5™ Tnp Transposome™ (Lucigen, TSM08KR) en 923 células competentes y luego se seleccionaron mutantes que perdían por completo o atenuaban parcialmente la actividad antagonista contra Xoo PXO99A. La clonación rescatada del sitio de inserción del transposón EZ-Tn5 en el ADN genómico 923 se proporcionó de acuerdo con los protocolos del fabricante.

Se generó un mutante por deleción de gacA mediante recombinación homóloga doble mediada por sacB. Las secuencias que flanquean a gacA a 716 pb aguas arriba y 487 pb aguas abajo se amplificaron mediante PCR utilizando los cebadores gacA-up-F1/gacA-up-R1 y gacA-down-F2/gacA-down-R2 (Datos complementarios 2), respectivamente. Los productos amplificados corriente arriba y corriente abajo se purificaron en gel, se digirieron con NdeI/KpnI y XbaI/NdeI, respectivamente, y se clonaron en p2P24Km66 para obtener la construcción p24-gacA (Datos complementarios 1). Después de la unión, esta construcción se introdujo en células competentes de E. coli DH5α y se cultivó en LB que contenía Km. Las colonias que contenían p24-gacA se confirmaron mediante PCR con los cebadores M13-F y M13-R (Datos complementarios 2) y se secuenciaron. El plásmido p24-gacA se introdujo en P. mosselii 923 mediante electroporación y las colonias con resistencia a la kanamicina y sensibilidad a la sacarosa se seleccionaron en NAN (NA sin sacarosa) que contenía Km (NAN + Km) y NAS (NA que contenía 10% de sacarosa) en sucesión. Las colonias que sobrevivieron a NAS se cultivaron individualmente en NA y NA + Km, y las colonias que crecieron en NA pero no en NA + Km se confirmaron mediante PCR con cebadores en Datos complementarios 2. La eliminación de gacA se confirmó mediante análisis de secuencia y se verificó adicionalmente mediante pruebas de bacteriostasis y producción de pseudoyodinina como se describió anteriormente.

Un fragmento de 1074 pb que contenía gacA y la región promotora cadena arriba se amplificó mediante PCR con los cebadores gacA-com-F y gacA-com-R (Datos complementarios 2). El producto de PCR se clonó en pUFR034 como un fragmento EcoRI/KpnI para producir el plásmido recombinante pUFR-gacA; esta construcción se confirmó por PCR con cebadores M13, se secuenció y luego se introdujo en P. mosselii 923 y el mutante ΔgacA por electroporación. Las colonias se seleccionaron en LB que contenía Km, se identificaron mediante PCR y se confirmaron adicionalmente mediante pruebas de bacteriostasis y producción de pseudoyodinina. El mutante complementado y las cepas que sobreexpresan gacA se denominaron CΔgacA y 923 pUFR-gacA, respectivamente.

P. mosselii 923 (WT) de tipo salvaje y el mutante knockout ΔgacA (KO) se cultivaron en LB durante 24 h. Se prepararon tres réplicas biológicas de cada cepa. Se recogieron células bacterianas (1 ml) y se centrifugaron durante 2 min a 9600 × g a 4 °C; esto se repitió con otra alícuota de 1 ml de células. Se retiraron los sobrenadantes, se congelaron en nitrógeno líquido durante 15 min y se almacenaron a -80 °C hasta que se necesitaron.

RNA-seq fue realizado por Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd. con el sistema Illumina HiSeq. Se usó el paquete DEseq R para analizar los DEG de KO en comparación con WT y se usó un valor P corregido (valor q) <0,005 y un cambio de veces log2 >1 para establecer la importancia. Los gráficos de volcanes se crearon con el paquete ggplots2 del lenguaje R y plot_volcano de soothsayer (https://github.com/jolespin/soothsayer) en Python v. 3.6.6. Los mapas de calor fueron producidos por el lenguaje R y el paquete de software Pheatmap (https://rdrr.io/cran/pheatmap/). Se utilizaron métodos de enlace euclidiano y completo para calcular la distancia y el agrupamiento, respectivamente.

Para verificar los datos de RNA-seq, se realizaron tres análisis independientes de PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) en muestras WT y KO usando los mismos tratamientos que se usaron para RNA-seq. Se seleccionaron aleatoriamente quince DEG para confirmación secundaria mediante análisis de RT-qPCR. El ARN total de las muestras WT y KO se extrajo con el kit EasyPure RNA (Transgen Biotech). El cDNA se preparó con el kit cDNA Synthesis Super Mix (Transgen Biotech). Se amplificaron fragmentos de PCR marcados con verde SYBR y se realizó RT-qPCR con un sistema de PCR en tiempo real ABI7500 (Applied Biosystems, EE. UU.). Se utilizó rpoD como control interno y gen de referencia, y para la cuantificación relativa se utilizó el método 2−ΔΔCt67. Todas las reacciones de RT-qPCR se realizaron tres o más veces de forma independiente utilizando los cebadores enumerados en Datos complementarios 2.

La deleción de genes psd individuales se logró mediante recombinación homóloga doble mediada por sacB como se describe anteriormente. Los cebadores utilizados para amplificar las secuencias que flanquean cada gen se enumeran en los Datos complementarios 2. Los mutantes de deleción se identificaron mediante PCR con los cebadores correspondientes (Datos complementarios 2) y se evaluaron adicionalmente para bacteriostasis y producción de pseudoyodinina. Los otros mutantes de deleción descritos en este estudio también se generaron mediante recombinación homóloga doble mediada por sacB.

Para los análisis de complementación, psdA, psdB, psdC, psdD, psdE, psdF y psdG y el promotor psdA fueron amplificados y clonados en pBSPPc para obtener los plásmidos pBS-psdA, pBS-psdB, pBS-psdC, pBS-psdD, pBS-psdE , pBS-psdF y pBS-psdG, respectivamente. (Datos complementarios 1). A continuación, se introdujeron construcciones en los mutantes de deleción correspondientes y se ensayó la complementación. Los mutantes rsmY y rsmZ se complementaron mediante clonación en pUFR034 utilizando el mismo protocolo.

Los plásmidos pBSPPc-Pseu-ORF y pNG1-P2064 se construyeron como se describe anteriormente. Los cebadores utilizados se enumeran en Datos complementarios 2 y fueron sintetizados por Shanghai Generay Biotech Co., Ltd. El pBSPPc-Pseu-ORF linealizado se obtuvo mediante PCR inversa con los cebadores pBS-Pseu-F2 y pBS-Pseu-R2 y se mezcló con pNG1 linealizado. -P2064 (Fig. 20d complementaria); la recombinación procedió utilizando los protocolos suministrados con el kit de clonación de un solo paso ClonExpress II (Vazyme, Nanjing, China). El producto de recombinación, pBSPPc-P2064-RBS-Pseu-ORF, se usó para transformar las células receptoras.

El operón de siete genes (psdABCDEFG) se clonó con su promotor nativo en pBSPPc. El fragmento de ADN de 7,2 kb se amplificó con los cebadores pBS-Pseu-F y pBS-Pseu-R (datos complementarios 2) y se purificó con un kit de extracción en gel. El fragmento de 7,2 kb se insertó en pBSPPc digerido con XbaI/BamHI y se clonó siguiendo las instrucciones proporcionadas con el ClonExpressII One Step Cloning Kit. La construcción resultante se denominó pBSPPc-ABCDEFG; este se introdujo en P. putida KT2440 mediante electroporación y se verificó por PCR.

La cepa de P. putida manipulada se cultivó en 20 ml de TSB complementada con 20 μg/ml de gentamicina, y las células se cultivaron a 30 °C, 220 rpm, durante 24 h. El caldo de fermentación se centrifugó y el sobrenadante se extrajo tres veces utilizando volúmenes iguales de acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se concentraron y disolvieron en metanol para análisis HPLC (Método B).

Para los experimentos de sobreexpresión, el plásmido pBSPPc-ABCDEFG (Datos complementarios 1) contenía el operón psdABCDEFG y su promotor nativo se introdujo en P. mosselii ΔcsrA1A2A3 como se describió anteriormente y se analizó para determinar la producción de pseudoyodinina.

El grupo de genes homólogos de pseudoyodinina (orf2184-2190) de P. mosselii DSM17497 y su promotor nativo se clonaron como un fragmento XbaI/BamHI en pBSPPc, lo que resultó en pBS-DSM17497-Pseu (datos complementarios 1). Este clon se introdujo en los mutantes 923 ∆psdB, ∆psdC y ∆psdG de P. mosselii para determinar si el operón DSM17497 psd podría complementar las cepas mutantes 923. Se generaron dos cepas de cada mutante (PsdB-comp.1 y PsdB-comp.2; PsdC-comp.1 y PsdC-comp.2, y PsdG-comp.1 y PsdG-comp.2) introduciendo el plásmido pBS- DSM17497-Pseu en los mutantes correspondientes por electroporación (Datos complementarios 1). Los mutantes complementados se evaluaron para bacteriostasis y producción de pseudoyodinina como se describe anteriormente.

DSM17497 contiene siete genes homólogos al operón de pseudoyodinina en P. mosselii 923, a saber, orf2184 (psdA), orf2185 (psdB), orf2186 (psdC), orf2187 (psdD), orf2188 (psdE), orf2189 (psdF) y orf2190 (psdG) . Se usó RT-PCR para determinar si los siete genes putativos de pseudoyodinina se expresaban en P. mosselii DSM17497. El ARN total de P. mosselii DSM17497 se extrajo con el kit EasyPure RNA (Transgen Biotech) y el ADNc se preparó con el kit cDNA Synthesis Super Mix (Transgen Biotech). El gen 16S rRNA se usó para la normalización. Los cebadores utilizados para RT-PCR se enumeran en Datos complementarios 2 y el experimento se repitió tres veces de forma independiente.

El ORF de gacA se amplificó mediante PCR con los cebadores gacA-F y gacA-R (datos complementarios 2) y se clonó en pET28a como un fragmento NdeI/XhoI. La construcción resultante, pET28-gacA, se transformó en E. coli BL21 (DE3). Para la sobreexpresión, se inoculó una sola colonia de E. coli BL21 en 20 ml de LB con Km y se cultivó durante la noche a 37 °C. A continuación, las células (5 ml) se transfirieron a 500 ml de LB y se cultivaron a 37 °C, 220 rpm hasta una DO600 = 0,6–0,8; Luego se indujeron las células con IPTG 0,5 mM y se cultivaron durante la noche a 16 °C. Los sedimentos se recolectaron por centrifugación a 4 °C, 3500 × g durante 10 min, se lavaron dos veces en PBS y se suspendieron en tampón A (Tris-HCl 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7,5) que contenía una concentración final de PMSF 1 mM ( fluoruro de fenilmetanosulfonilo). Las células se rompieron mediante sonicación y los extractos libres de células se obtuvieron mediante centrifugación a 4 °C, 13 800 × g durante 30 min. Los sobrenadantes se aplicaron a la resina de agarosa His Sep Ni-NTA (Yeasen Biotechnology), que se equilibró con el tampón A antes de su uso. La columna de Ni-NTA se lavó tres veces con tampón A y la columna se eluyó con un gradiente de imidazol 20-250 mM en tampón A. Las fracciones de 20 a 250 mM se agruparon y separaron mediante SDS-PAGE. La fracción que contenía GacA se concentró y se intercambió con tampón de almacenamiento (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 5%, pH 7,5). La concentración de proteína se estimó utilizando un microespectrofotómetro Nano-300 (Hangzhou Allsheng Instruments Co.), y la preparación se almacenó a -80 °C hasta que se necesite.

Las sondas promotoras marcadas con Cy5 que contienen el motivo UAS (TGTAAG-N6-CTTACA) en rsmY y rsmZ se sintetizaron comercialmente (Shanghai DNA Bioscience Co. Ltd). La EMSA se realizó utilizando protocolos establecidos68. Brevemente, el His-GacA purificado se mezcló con fragmentos de promotor rsmY y rsmZ marcados con Cy5, respectivamente, y luego se cargó en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 4,5% para electroforesis. El fluoróforo Cy5 se detectó usando un Amersham Typhoon RGB Biomolecular Imager (Cytiva, Suecia). Los experimentos de EMSA se repitieron tres veces de forma independiente.

Las CIM de pseudoyodinina y PCA para Xanthomonas spp. se determinaron por dilución en serie. Se preparó NA que contenía pseudoyodinina a 0–64 μg/mL o PCA a 0–256 μg/mL. Se diluyeron tres veces dos microlitros de suspensión bacteriana (OD600 = 1,0) y se colocaron en placas NA. Después de una incubación de 48 h a 28 °C, las CIM se definieron como la concentración más baja a la que no se veía crecimiento.

Los valores de EC50 de pseudoyodinina y PCA se determinaron de acuerdo con la inhibición del crecimiento. Brevemente, se agregaron 10 μL de suspensión bacteriana a 5 mL de NB que contenía concentraciones diluidas de pseudoyodinina y PCA. Los valores de OD600 de las suspensiones probadas se midieron cuando las suspensiones de control aumentaron a OD600 = 1,0. Se hizo una regresión del logaritmo del porcentaje de inhibición basado en los valores de DO600 sobre el logaritmo de las concentraciones del compuesto, y se calcularon los valores de EC50. Este experimento se realizó tres o más veces de forma independiente.

La EC50 de M. oryzae R01-1 se determinó in vitro transfiriendo tapones (0,5 cm2 de diámetro) de micelio de una colonia fúngica en crecimiento activo a una serie de placas OAM que contenían pseudoyodinina a 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 y 50 µM. Los diámetros de las colonias fúngicas se midieron después de una incubación de cinco días a 25 °C en la oscuridad, y la inhibición se calculó como porcentaje del crecimiento de control. Los valores de EC50 se calcularon en base a la regresión lineal del diámetro de la colonia en las concentraciones de pseudoyodinina transformadas logarítmicamente. Los experimentos se realizaron tres veces de forma independiente.

La significación estadística se calculó utilizando el método de prueba de diferencia mínima significativa (LSD) y el análisis ANOVA unidireccional para comparaciones múltiples utilizando SPSS v. 22.0. El valor de las pruebas estadísticas representa estadísticamente significativo en las leyendas de las figuras de la siguiente manera: *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001, ANOVA unidireccional seguido de prueba LSD. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE). Los datos estadísticos se analizaron utilizando GraphPad Prism versión 8.00. Las áreas de lesiones se calcularon a partir de hojas infectadas utilizando Adobe Photoshop CS5. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces de forma independiente para confirmar la reproducibilidad.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en este manuscrito y en su archivo de información complementaria. Los datos de la secuencia del genoma de Pseudomonas mosselii 923 utilizados en este estudio se depositaron en la base de datos NCBI GenBank con el código de acceso de BioProject PRJNA826312 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_CP095556). Los datos del transcriptoma se han depositado en el archivo de lectura de secuencias del NCBI y se puede acceder a ellos con el código PRJNA880759. Los datos cristalográficos para la estructura de la pseudoyodinina informados en este artículo se depositaron en el Centro de datos cristalográficos de Cambridge, con el número de depósito CCDC 2175188. Se pueden obtener copias de los datos de forma gratuita a través de www.ccdc.cam.ac.uk. Las cepas, los plásmidos y los cebadores utilizados en este estudio se informan en los Datos complementarios 1–2. Los datos de origen se proporcionan con este documento. Los datos también están disponibles del autor correspondiente a pedido. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a la Prof. Carol Bender (Universidad Estatal de Oklahoma), al Prof. Feng Ge (Instituto de Zoología, Academia de Ciencias de China) y al Prof. Xuewen Gao (Universidad Agrícola de Nanjing) por su visión crítica de este proyecto. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2022YFD1400200, 2017YFD0200400), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31830072) y el Programa de Desarrollo de Tecnología Aplicada a la Agricultura de Shanghai de China (2020‐02‐08‐00). ‐08‐F01462).

Estos autores contribuyeron por igual: Ruihuan Yang, Qing Shi.

Centro de Innovación Colaborativa de Shanghái de Semillas Agrícolas/Escuela de Agricultura y Biología, Universidad Jiao Tong de Shanghái, Shanghái, 200240, China

Ruihuan Yang, Yichao Yan, Shengzhang Li, Yuan Fang, Ying Li, Linlin Liu, Longyu Liu, Yongzheng Peng, Jiangbo Fan, Lifang Zou y Gongyou Chen

Laboratorio Estatal Clave de Metabolismo Microbiano, Facultad de Ciencias de la Vida y Biotecnología, Universidad Jiao Tong de Shanghái, Shanghái, 200240, China

Qing Shi, Tingting Huang, Xiaozheng Wang, Lifang Zou, Shuangjun Lin y Gongyou Chen

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GC y LZ supervisó el estudio. RY, YY, Ella. L., YF, YL, Li. L., Lo. L. y YP recolectaron muestras de suelo. RY y ella. L. cepas bacterianas aisladas. RY y LZ realizaron experimentos de ensayos bioquímicos, complementarios y de eliminación de genes. Compuestos identificados por RY y QS. RY y JF ejecutan ensayos de biocontrol. QS, TH y XW realizaron experimentos de biosíntesis. RY y QS analizaron los datos y escribieron el manuscrito. TH, Shu. L. y GC revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Lifang Zou o Gongyou Chen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Yang, R., Shi, Q., Huang, T. et al. La pseudoiodinina de pirazolotriazina natural de Pseudomonas mosselii 923 inhibe los patógenos bacterianos y fúngicos de las plantas. Nat Comun 14, 734 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36433-z

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Recibido: 12 junio 2022

Aceptado: 01 febrero 2023

Publicado: 09 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36433-z

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