El núcleo colinérgico basal del prosencéfalo de Meynert regula el dolor crónico

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 5014 (2022) Citar este artículo

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El núcleo basal de Meynert (NBM) cumple funciones de importancia crítica en la atención, la excitación y la cognición a través de su profunda modulación de la actividad neocortical y está emergiendo como un objetivo clave en las demencias de Alzheimer y Parkinson. Sin embargo, a pesar del papel crucial de los dominios neocorticales en la percepción del dolor, el NBM no se ha estudiado en modelos de dolor crónico. Aquí, utilizando grabaciones de tetrodo in vivo en ratones que se comportan, informamos que la actividad oscilatoria beta y gamma se evoca en el NBM por estímulos nocivos y se facilita en el comportamiento inflamatorio máximo similar al dolor. Las manipulaciones reversibles optogenéticas y quimiogenéticas específicas de células de las neuronas colinérgicas-GABAérgicas de NBM revelan su papel en el control endógeno de la hipersensibilidad nociceptiva, que se manifiesta a través de proyecciones a la corteza prelímbica, lo que resulta en una antinocicepción mediada por la capa 5. Nuestros datos revelan la importancia del NBM en el control de arriba hacia abajo del procesamiento neocortical del comportamiento similar al dolor.

Un obstáculo importante para la terapia adecuada de los trastornos de dolor crónico es el conocimiento incompleto de los circuitos cerebrales que subyacen a la percepción del dolor y su modulación durante la transición del dolor agudo al crónico. Por lo tanto, su elucidación es importante para generar conocimientos mecanicistas, así como para el avance terapéutico. Estudios recientes sobre el interrogatorio funcional de los circuitos cerebrales han llevado a avances en las propiedades estructura-función de algunas redes cerebrales involucradas en el dolor y, en particular, han revelado funciones clave para los dominios neocorticales1. La percepción del dolor está sujeta a una profunda modulación por factores contextuales, ambientales y psicosociales. Como mecanismos neuronales contribuyentes, ahora están surgiendo conocimientos sobre la modulación del procesamiento neocortical por la entrada aferente de las vías GABAérgicas, dopaminérgicas y serotoninérgicas2.

En comparación, se sabe muy poco sobre el alcance y las funciones de las vías colinérgicas en el cerebro para modular la percepción del dolor. Esto contrasta con extensos estudios farmacológicos de las últimas dos décadas, que informan los efectos de la señalización colinérgica a través de los receptores nicotínicos ionotrópicos y los receptores muscarínicos metabotrópicos sobre el dolor y la analgesia3. La administración sistémica, periférica y espinal de ligandos colinérgicos modula la nocicepción y los estudios con administración central han implicado la señalización colinérgica en la analgesia opioidérgica y los sistemas moduladores descendentes. Sin embargo, ha habido muy poco progreso en la explotación de la modulación colinérgica hacia el alivio del dolor, debido principalmente a las grandes lagunas en la comprensión de los circuitos subyacentes, en particular con respecto a la delimitación del origen de las entradas colinérgicas. Esto es particularmente importante porque tanto los efectos facilitadores como los inhibidores están asociados con la modulación farmacológica de los receptores colinérgicos, que pueden atribuirse no solo a la diversidad de la señalización mediada por receptores, sino también al lugar de la modulación colinérgica en el sistema nervioso.

En el cerebro, las neuronas colinérgicas abundan en forma de interneuronas locales en áreas específicas, como el putamen caudado, o se organizan en los núcleos colinérgicos Ch1-Ch6 del prosencéfalo basal y el tronco del encéfalo para funcionar como neuronas de proyección con objetivos distantes4. Entre estos, el sistema del prosencéfalo basal comprende grupos discretos de células colinérgicas (Ch1-Ch4), con neuronas en el tabique medial (MS) y la rama vertical de la banda diagonal de Broca (vDB) que se dirigen principalmente al hipocampo, mientras que las neuronas en Ch4 explica en gran medida la entrada colinérgica en el manto neocortical y también se proyecta a la amígdala4. En el cerebro de roedores, la estructura más análoga a la Ch4 está dada por el núcleo basal magnocelularis (NBM; núcleo basal de Meynert), que también se extiende en una banda ventral a la comisura anterior llamada sustancia innominada, que se denominan colectivamente bajo el término NBM en este estudio, de acuerdo con varios otros estudios publicados (p. ej., ref. 5; vista esquemática en la Fig. 1a). Este sector contiene el mayor componente de las proyecciones corticopetales del prosencéfalo basal y es de naturaleza abrumadoramente colinérgica. Al NBM se le ha atribuido un papel modulador en funciones clave específicas, como la excitación, la atención, el miedo y las interacciones sociales, incluida la memoria de reconocimiento social5. Además, el NBM se ha implicado en la agudización de la agudeza del procesamiento sensorial al mejorar la relación "señal a ruido" en los circuitos corticales a través de mecanismos nicotínicos y muscarínicos que involucran tanto a las neuronas piramidales como a las interneuronas GABAérgicas6,7. Estas propiedades colocan potencialmente al NBM en una posición crítica para modular la percepción del dolor y su plasticidad, dada la importancia del procesamiento neocortical en el dolor1. Sorprendentemente, sin embargo, el NBM apenas se ha estudiado en el contexto del dolor, salvo algunos estudios con lesiones excitotóxicas y amplia ablación de grupos colinérgicos mediada por toxinas. Es importante destacar que no se han realizado estudios que delineen funcionalmente el circuito nativo subyacente. Además, aún se desconoce si los patrones de actividad en el NBM cambian en asociación con el dolor y cómo el NBM experimenta plasticidad durante la transición al dolor crónico in vivo.

a Esquema de los principales núcleos colinérgicos en el cerebro del ratón (b, c) Ejemplos típicos (a) y cuantificación (b) del aumento inducido por capsaicina en la inmunohistoquímica Fos en neuronas colinérgicas NBM (ChAT + ve; flechas: células comarcadas). n = 3 ratones/grupo; P < 0,05 (*0,0103, #0,0263), ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. d Representación esquemática (procedente de la ref. 31) de grabaciones de tetrodo in vivo en el NBM (flecha blanca: lesión de la punta del electrodo en la sección) en respuesta a la estimulación mecánica de von Frey de la pata trasera. e Representación media de tiempo-frecuencia de la modulación espectral en el NBM para todas las pruebas con respuesta de retirada de la pata a filamentos débiles (0,07 g y 0,16 g) o filamentos fuertes (0,6 g y 1 g). f, g Cuantificación correspondiente de la potencia (f) de la actividad oscilatoria en los rangos de frecuencia theta (4–8 Hz), alfa (8–14 Hz), beta (14–30 Hz) y gamma (30–100 Hz), representada como % de cambio en el período posterior a la aplicación de 2 s sobre la actividad de referencia de 1 s antes de la aplicación del estímulo y el curso de tiempo correspondiente (g); línea azul vertical: tiempo de retirada de la pata. En e, g, n = 5 ratones; *P < 0,05; Se empleó la prueba t de una muestra (dos colas) en f; Los valores de t y P para los diferentes grupos son los siguientes: Filamentos débiles: t = 2,06, 1,89, 3,10, 2,60; P = 0,108, 0,132, 0,036, 0,060; Filamentos fuertes: t = 2,50, 2,57, 3,07, 3,81; P = 0,067, 0,062, 0,037, 0,019; para theta, alfa, beta y gamma, respectivamente. Se empleó ANOVA unidireccional de medidas repetidas con comparación múltiple de Dunnet frente a la línea de base previa a la estimulación en g (* P = 0,0058, 0,0007, 0,0143, 0,0048, 0,0021, 0,0019, 0,0106, 0,0013, 0,0005, 0,0007, 0,0001, 0. 0028, 0.0013, 0,0006, 0,0011, 0,0148 para beta y 0,0091, 0,0002, 0,0045, 0,0012, 0,0001, 0,0022, 0,0036, 0,0016, 0,0005, 0,0012, 0,0451, 0,0015 , 0,0124, 0,0197 para intervalos de tiempo de potencia gamma, de izquierda a derecha, respectivamente). Las barras de escala representan 0,5 mm y 50 µm (derecha) en by 250 µm en d. MS núcleo septal medial, vDB banda diagonal de Broca, LDT núcleo tegmental laterodorsal, PPT núcleo tegmental pedunculopontino, mPFC corteza prefrontal medial, comisura anterior ac, putamen caudado de CPu, GP glopus pallidus, núcleo LOT del tracto olfatorio lateral, haz del prosencéfalo medial mfb , cápsula interna ic, potencial relacionado con eventos ERP o perturbación. Los datos se presentan como media +/- error estándar de la media (SEM).

Aquí, realizamos grabaciones in vivo utilizando tetrodos para capturar dinámicamente los cambios en la actividad de las neuronas individuales, así como los ritmos de campo oscilatorio en el NBM en ratones que se mueven libremente y se comportan durante la nocicepción y la transición a la hipersensibilidad inflamatoria. Informamos respuestas específicas del NBM a estímulos que inducen dolor (nocivos), que demuestran un cambio en la capacidad de respuesta a estímulos de baja intensidad en un modelo de dolor inflamatorio, lo que refleja la hipersensibilidad conductual. Simultáneamente, los ritmos oscilatorios gamma y beta experimentan una potenciación del poder espectral. Usando manipulaciones optogenéticas y quimiogenéticas reversibles y específicas del tipo de célula junto con el comportamiento, demostramos que esta potenciación de la actividad colinérgica en el NBM y sus proyecciones a la corteza prefrontal suprime la hipersensibilidad nociceptiva en condiciones de dolor inflamatorio y neuropático, allanando así el camino para estrategias terapéuticas dirigidas específicamente a estos grupos de células colinérgicas.

La inyección intraplantar de capsaicina en las patas traseras en ratones de tipo salvaje, que induce de forma aguda un dolor tónico fuerte, condujo a un aumento significativo en la expresión del producto génico temprano inmediato dependiente de la actividad, Fos, en el NBM (se muestra esquemáticamente en la Fig. 1a), incluidas las neuronas colinérgicas como se ve a través del marcaje conjunto para el marcador colina acetiltransferasa (ChAT; Fig. 1b). A continuación, nos enfocamos en esta área en experimentos de electrofisiología en ratones despiertos y con comportamiento para estudiar directamente los cambios en la actividad de NBM, tanto a nivel de potenciales de campo como de células individuales usando tetrodos. La aplicación de fuerza mecánica a través de los filamentos de von Frey se asoció con un aumento en la actividad en todas las bandas de frecuencia sobre los niveles de actividad de referencia (pre-estímulo) (Fig. 1d, e; también vea la Fig. 1a complementaria). En múltiples ensayos y animales, el aumento fue estadísticamente significativo en el poder de las oscilaciones beta (14–30 Hz) cuando se aplicaron estímulos en y por encima de los umbrales nociceptivos (fuerza de von Frey de 0,6–1,0 g), así como con baja intensidad. , estímulos táctiles no nocivos (0.07–0.16 g), mientras que el poder de las oscilaciones gamma (30–100 Hz) aumentó selectivamente con la estimulación de la fuerza nociceptiva (Fig. 1f). Este hallazgo es particularmente interesante porque las oscilaciones gamma en las áreas corticales se han relacionado funcionalmente con la nocicepción en estudios con humanos y roedores8,9,10, y se sabe que están asociadas con la sincronización de la actividad a través de las interneuronas GABAérgicas11. El aumento inducido por la estimulación mecánica nociva en la actividad beta y la actividad gamma alcanzó niveles estadísticamente significativos antes de la respuesta nocifensiva del comportamiento y se mantuvo durante 2 s después de la aplicación del estímulo (Fig. 1g, para comparación, los datos sobre la estimulación no nociva son se muestra en la figura complementaria 2b).

A continuación, buscamos probar la importancia potencial del NBM en la progresión de la nocicepción a la hipersensibilidad que es característica del dolor inflamatorio persistente. De hecho, los ratones con inflamación unilateral de la pata trasera inducida por inyección de adyuvante completo de Freund (CFA), que demuestran hipersensibilidad nociceptiva (Fig. 1c complementaria), demostraron una expresión mejorada de Fos en neuronas colinérgicas en el NBM (Fig. 2a, b). Luego comparamos la actividad oscilatoria entre condiciones ingenuas y después de que se estableció la hipersensibilidad inducida por CFA. A las 24 h después de la inyección de CFA en la pata trasera, que corresponde al momento en que la hipersensibilidad conductual a la estimulación mecánica alcanza un pico en nuestras manos, la estimulación de la pata provocó un aumento significativamente mayor en el poder de los ritmos beta y gamma (Fig. 2c, d ), pero no de actividad alfa y theta (Fig. 1d complementaria) en el NBM. Un hallazgo interesante fue que el aumento del poder gamma y beta asociado con el dolor inflamatorio se observó con intensidades bajas de estimulación mecánica, que generalmente no son nocivas en condiciones fisiológicas pero se perciben como nocivas en el estado inflamado (Fig. 2e). Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que el NBM se recluta durante la nocicepción y muestra una facilitación de su capacidad de respuesta durante la transición a la hipersensibilidad en el comportamiento inflamatorio similar al dolor.

a, b Comparación de la actividad de las neuronas colinérgicas del NBM en presencia o ausencia de aplicación de estimulación mecánica con 0,16 g de fuerza en la pata trasera plantar contralateral en condiciones basales o 1 día después de la inyección de CFA. Se muestran ejemplos típicos (a) y cuantificación (b); n = 4 ratones/grupo; P < 0,05 (*0,0005, #0,0134), ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. c Representación de frecuencia de tiempo de la potencia espectral en el NBM en ratones el día 1 después de la inyección de CFA (n = 5 ratones/tratamiento). d, e Comparación del poder de la actividad oscilatoria en rangos de frecuencia beta y gamma entre condiciones ingenuas (falsas) y CFA el día 1, calculado como % de aumento en el período posterior a la aplicación de 2 s sobre la actividad de referencia de 1 s antes de la aplicación del estímulo. Se muestran las curvas de estímulo-respuesta (d) o el análisis del cambio porcentual en la potencia espectral (e) en respuesta a filamentos inocuos (0,07 y 0,16 g) y presión mecánica nociva (0,6 a 1,0 g); n = 5 ratones/grupo; *P < 0,05 (0,0417 para 0,07 g, 0,0244 para 0,16 g en d; 0,0425 para beta débil y 0,0095 para gamma débil en e), ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Los datos se presentan como media +/- SEM.

El análisis de la actividad a nivel de una sola célula a través de la clasificación de picos condujo a interesantes conocimientos sobre la naturaleza celular de la capacidad de respuesta de NBM y la plasticidad en el dolor. Entre las 221 unidades registradas en condiciones ingenuas, menos del 10% mostró un aumento constante o una disminución en la tasa de disparo en los ensayos de retirada al aplicar 20 estimulaciones mecánicas de la pata con el filamento débil o fuerte (Fig. 3a, b); Los trazos de ejemplo y las puntuaciones Z promedio (que indican el número de desviaciones estándar para los puntos de datos por encima o por debajo de la media) se muestran en la Fig. 3a y las proporciones de la unidad en la Fig. 3b. En ratones con un comportamiento similar al dolor inflamatorio, la proporción de unidades que respondieron a la estimulación mecánica no cambió significativamente durante la hipersensibilidad fuerte durante los primeros 4 días después de la inyección de CFA (Fig. 3b y Fig. 2a complementaria). Sin embargo, durante este período, los valores máximos de puntuación z aumentaron significativamente en las neuronas excitadas por intensidades nocivas de estimulación mecánica (Fig. 3c), pero no en las neuronas inhibidas por estimulación mecánica (Fig. 2b complementaria), lo que corresponde al aumento general en el potencia de la actividad oscilatoria que observamos en el nivel LFP. Además, al analizar la forma de la onda de punta, clasificamos las unidades en Clase 1 (Fig. 3d) y Clase 2 (Fig. 3e) con formas de onda de punta ancha o estrecha, respectivamente12; Las clases de aumento rápido de neuronas e interneuronas de proyección GABAérgica están representadas dentro de las unidades de clase 213. Curiosamente, solo las neuronas de clase 2 mostraron un aumento estadísticamente significativo en la actividad en respuesta a la estimulación sensorial en ratones con inflamación de la pata en comparación con los ratones de control (Fig. 3d, e). Estos datos sugieren que las neuronas del NBM, que son excitadas por estímulos mecánicos, experimentan una facilitación sobre la manifestación de la hipersensibilidad nociceptiva inflamatoria y, además, que las neuronas GABAérgicas de clase 2 de pico rápido en el NBM contribuyen particularmente a estos cambios. Este hallazgo es digno de mención, ya que en el NBM de ratón, se sabe que el 92% de las neuronas colinérgicas que expresan ChAT son GABAérgicas14. En puntos de tiempo tardíos después de la inyección de CFA (7-14 días), después de que se recupera la sensibilidad nociceptiva normal, observamos que los patrones de actividad oscilatoria y unicelular en el NBM no solo se normalizan, sino que en parte incluso caen por debajo de los valores de referencia (Figs. 2b y 3a, b).

a Ejemplos típicos (paneles superiores) y puntajes z promedio, que representan el número de desviaciones estándar para los puntos de datos por encima o por debajo de la media, lo que demuestra las unidades NBM que se excitan con la estimulación nociva de la pata (panel más a la izquierda), las unidades que son actividad suprimida por la estimulación de la pata (panel central) y unidades que no se alteran significativamente en la actividad después de la estimulación de la pata. b Distribución de las unidades de NBM que responden a la estimulación mecánica en condiciones ingenuas (falsas) y durante el comportamiento similar al dolor inflamatorio máximo inducido por CFA de la pata trasera (día 1-4). c–e La mejora máxima de la actividad sobre los valores de referencia promedio para las unidades excitadas por estimulación mecánica se demuestra en ratones ingenuos y post-CFA. En d, e, las unidades se subdividen en clase 1 (d) y clase 2 (picos rápidos; e) tipos de neuronas según la forma de onda. n = 5 ratones/grupo; *P < 0,05 (0,0412 en c; 0,0191 en e), ANOVA bidireccional con prueba de comparaciones múltiples de Sidak (c) y prueba t de dos colas no apareadas (d, e). Los datos se presentan como media +/- SEM.

Para descubrir directamente la importancia de nuestros hallazgos, empleamos un enfoque optogenético específico de la célula al dirigir el canal catiónico canalrodopsina activado por luz azul a las neuronas que expresan ChAT. Se inyectaron estereotácticamente viriones adenoasociados recombinantes (AAV) para expresar Channelrhodopsin marcado con proteína fluorescente amarilla de una manera dependiente de Cre (rAAV-Dio-ChR2-YFP) unilateralmente en el NBM de ratones transgénicos ChAT-Cre (Fig. 4a, b ). Los ratones Cre-negativos sometidos a los mismos tratamientos sirvieron como controles. La entrega de luz azul al NBM a través de fibras ópticas implantadas crónicamente aumentó significativamente la expresión de Fos en las neuronas colinérgicas, estableciendo así la validación in vivo del enfoque (Fig. 4c, d). Tras la estimulación con luz azul, la sensibilidad inicial a los estímulos mecánicos permaneció sin cambios (Fig. 4e, línea base); sin embargo, el cambio hacia la izquierda y hacia arriba en la función de estímulo-respuesta de von Frey, que representa la manifestación de la hipersensibilidad inflamatoria, se redujo significativamente en los ratones Cre+ en comparación con los controles Cre- cuando se probaron en la sensibilización máxima el día 2 después de la CFA. (Fig. 4e, panel central). Del mismo modo, el umbral de abstinencia mecánica aumentó significativamente en ratones con CFA tras la estimulación con luz azul en Cre+, pero no en los ratones de control Cre- (Fig. 4f). En general, la magnitud de la hipersensibilidad mecánica sobre los valores iniciales disminuyó y el retorno a la sensibilidad inicial fue más rápido con la estimulación optogenética de las neuronas colinérgicas NBM (Fig. 4f). Sin embargo, la hiperalgesia por calor inducida por CFA no se alteró significativamente en magnitud o duración (Fig. 4g).

un esquema para la manipulación optogenética de neuronas colinérgicas NBM con luz láser azul. b–d Expresión de la opsina excitatoria, Channelrhodopsin-EYFP en el NBM (b), ejemplos típicos (c) y cuantificación (d) de expresión mejorada de Fos en neuronas EYFP+ y ChAT+ (flechas en c) con luz azul, validando así la eficacia de la activación optogenética in vivo. n = 3 ratones/grupo; *P < 0,05 (0,0234, arriba; 0,0183, abajo), prueba t de dos colas para datos no apareados. Barra de escala = 200 µm en b y 25 µm en c. e, f Atenuación significativa de la hipersensibilidad mecánica máxima (día 2) inducida por la inyección intraplantar de CFA, que se muestra como curvas de estímulo-respuesta (e) y umbrales de abstinencia (f) en respuesta a la estimulación de von Frey; Los valores de P en el recuadro representan una comparación basada en ANOVA de las dos curvas completas de estímulo-respuesta. g Falta de modulación de la hipersensibilidad a una rampa de calor. e, fn = 7 ratones ChAT-Cre- y 8 ChAT-Cre+; P < 0,05 (*0,0275, medio en e; *0,0139, #0,0231, medio en f), ANOVA de dos vías con prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Los datos se presentan como media +/- SEM.

Debido a que el NBM se proyecta a una gran cantidad de objetivos neocorticales, muchos de los cuales afectan el dolor y la hipersensibilidad de múltiples maneras, buscamos diseccionar la importancia de las proyecciones neuronales del NBM en la corteza prefrontal medial (mPFC), que representa un centro clave en el cerebro. circuitos subyacentes al dolor. La mPFC experimenta una marcada plasticidad en varias condiciones clínicas de dolor crónico en humanos y, en particular, ha surgido un enfoque importante en su desactivación observada en algunos pacientes con dolor crónico15, un hallazgo que también se informa en modelos animales de dolor neuropático16,17,18,19. Por lo tanto, expresamos ChR2-YFP en las neuronas ChAT del NBM y colocamos la fibra óptica para la iluminación con luz azul en la corteza prelímbica (PL), la contraparte del ratón del mPFC humano (Fig. 5a). La activación selectiva de las proyecciones colinérgicas de NBM en el PL no influyó en la sensibilidad mecánica inicial, pero tuvo un efecto analgésico aún más fuerte que la activación directa de las neuronas NBM en la hipersensibilidad mecánica inducida por CFA, que se revirtió por completo a los valores iniciales (Fig. 5b). Además, la hipersensibilidad térmica se suprimió significativamente durante un largo período posterior a la CFA en ratones con estimulación optogenética de las proyecciones NBM-PL (Fig. 5c).

a–c Esquema para estimular optogenéticamente las proyecciones colinérgicas-GABAérgicas de NBM-PL y su impacto en la hipersensibilidad mecánica inflamatoria (día 2; b) y al calor (c); Los valores de P en el recuadro (b) representan una comparación basada en ANOVA de las dos curvas completas de estímulo-respuesta. n = 6 ratones ChAT-Cre- y 11 ChAT-Cre+; P < 0,05 (*0,0043, panel derecho en b; *,# < 0,0001 para los días 3 y 8 de CFA en (c)), ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. d Esquema de conectividad entre las proyecciones colinérgicas-GABAérgicas de NBM, aferentes excitatorios y diversas neuronas PL que impactan en la activación de las neuronas piramidales PL a través de la señalización colinérgica nicotínica y muscarínica. IN interneurona GABAérgica, PN neurona piramidal; tipos de interneuronas GABAérgicas: tipo parvalbúmina PV, tipo somatostatina SOM, tipo péptido intestinal vasoactivo VIP. e Imágenes de ejemplo de inmunohistoquímica anti-YFP que muestran proyecciones de NBM al PL (ampliación a la derecha) y cortezas adyacentes (izquierda: diferentes campos confocales de alta resolución unidos). Barras de escala = 250 µm (izquierda) y 100 µm (derecha). f–h Cuantificación de Fos de todas las capas de PL o capa 5 (f) y en neuronas de proyección excitatoria (SATB2- o Ctip2; g) y neuronas inhibidoras (PV o SOM; h) en respuesta a la estimulación optogenética de NBM-PL colinérgico-GABAérgico proyecciones (representadas por ratones Cre+) o control (representados por ratones Cre-) (todos los ratones están "Láser ON"). N = 5 ratones/grupo para paneles f-h; *P < 0,05 (todas las capas: 0,0091, simulado, <0,0001, CFA; capa 5: 0,0036, simulado, <0,0001, CFA), ANOVA de dos vías seguido de la prueba post hoc de Sidak para f y prueba t de dos colas para datos no apareados para g (P = 0,0166, para SATB2 y 0,0066 para Ctip2) y h. Solo los ratones inyectados con CFA están representados en g, h. i Hipersensibilidad mecánica inflamatoria en ratones Rbp4-Cre que expresan el DREADD excitatorio, hm3D(Gq) de manera dependiente de Cre. n = 8 ratones/grupo; *P < 0,05 (0,0019, 0,0019, 0,0002 para filamentos de 0,07, 0,16 y 0,4 g, respectivamente), ANOVA bidireccional con prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Los datos se presentan como media +/- SEM.

Los estudios electrofisiológicos y de modelado indican que las entradas colinérgicas del prosencéfalo basal ejercen efectos excitadores directos a través de la señalización mediada por receptores en las neuronas piramidales corticales y también tienen la capacidad de evocar la inhibición o desinhibición de las neuronas piramidales a través de la señalización en diferentes clases de interneuronas GABAérgicas neocorticales locales o vía señalización a través de diferentes tipos de receptores nicotínicos y muscarínicos14,20. Curiosamente, estudios recientes también indican que el GABA se libera conjuntamente a partir de proyecciones colinérgicas que se originan en los núcleos del prosencéfalo basal y, por lo tanto, puede desinhibir las neuronas piramidales neocorticales al suprimir las interneuronas inhibidoras locales14,21 (esquema en la Fig. 5d). Se ha sugerido que ambos mecanismos actúan para mejorar el procesamiento cortical de señal a ruido de entradas sensoriales, por ejemplo, entradas visuales en la corteza visual y entradas táctiles en la corteza somatosensorial21. Para abordar cómo las proyecciones colinérgicas-GABAérgicas de NBM-PL afectan al PL, realizamos un rastreo viral y un mapeo de c-Fos en capas junto con optogenética. Curiosamente, mientras que las proyecciones de NBM a la mayor parte del manto neocortical abarcan de forma difusa todas las capas corticales, nuestros análisis de seguimiento revelaron que las proyecciones de NBM a PL terminan en la capa 5 de una manera particularmente abundante en comparación con otras capas (Fig. 5e; comparar con vecinos corteza motora M2 y dominios corticales del cíngulo). Tanto en condiciones de referencia (ratones ingenuos) como en ratones con un comportamiento similar al dolor inflamatorio, la estimulación optogenética de las proyecciones de NBM-PL condujo a un aumento significativo en los niveles de Fos en todo el PL, incluidas la capa 2/3, la capa 5 y la capa 6 (Fig. 5f y la Fig. 4a complementaria; todos los puntos de datos representan condiciones de 'láser ENCENDIDO'). Las neuronas PL que expresan Fos aumentaron con la inflamación de la pata en comparación con los niveles basales en todos los ratones; sin embargo, la activación optogenética de las conexiones NBM-PL en ratones que expresan ChR2 mejoró el número de neuronas PL que expresan Fos en ratones inyectados con CFA más allá del aumento inducido por la inflamación (Fig. 5f y Fig. 4a complementaria; todos los puntos de datos representan "láser ON"). Luego realizamos una caracterización detallada de la naturaleza de las neuronas Fos+ en ratones inyectados con CFA utilizando anticuerpos anti-SATB2 para marcar las neuronas excitatorias que muestran una preferencia relativa por las neuronas de asociación que se proyectan intratelencefálicamente a otras áreas neocorticales22 y anticuerpos anti-Ctip2 para marcar neuronas excitatorias que se proyectan subcorticalmente23, y anticuerpos anti-parvalbúmina y anti-somatostatina para marcar las dos poblaciones más abundantes de neuronas GABAérgicas11. Observamos que la estimulación optogenética de las proyecciones NBM-PL mejora la activación de Fos en las poblaciones de neuronas de proyección excitatoria SATB2 y Ctip2 (Fig. 5g), pero no altera la actividad de las neuronas GABAérgicas en el PL (Fig. 5h). Estudios recientes han demostrado que una salida clave del PL se compone de neuronas piramidales de la capa 5 en el PL que se proyectan a la sustancia gris periacueductal y, por lo tanto, se vinculan a los sistemas moduladores nociceptivos descendentes24. Por lo tanto, estimulamos selectivamente las neuronas de la capa 5 quimiogenéticamente al dirigir viralmente la expresión de hM3D (Gq)25 en la línea Rbp4-Cre específica de la capa 5 y observamos que la mejora selectiva de las salidas de la capa 5 en el PL imita la acción antihiperalgésica de la estimulación NBM-PL en la alodinia mecánica en ratones con CFA, mientras que la sensibilidad inicial no se alteró (Fig. 5i, panel izquierdo; la expresión de mCherry se empleó como control, Fig. 5i, panel derecho).

Desde el punto de vista de la relevancia traslacional, es importante abordar si la orientación del sistema colinérgico NBM también es beneficiosa en otras formas de dolor, en particular el dolor neuropático. Por lo tanto, abordamos si el sistema colinérgico NBM se recluta en el estado de dolor neuropático y está relacionado con la alodinia mecánica mediante el estudio de la expresión de Fos en ausencia o tras la aplicación plantar de fuerza mecánica de von Frey de baja intensidad, que es inocua en condiciones de referencia. La expresión de Fos en el NBM se elevó significativamente en ratones neuropáticos en comparación con ratones con lesiones simuladas y mostró un aumento adicional con la estimulación de la pata asociada con alodinia mecánica (Fig. 6a, b). Es importante destacar que esto también se reflejó en las neuronas colinérgicas que expresan ChAT (Fig. 6a, b), lo que sugiere un mayor reclutamiento por parte de estímulos que son inocuos en condiciones de referencia pero que se perciben como nocivos en condiciones de dolor neuropático, mostrando así paralelos a nuestros hallazgos en experimentos electrofisiológicos en el modelo de dolor inflamatorio descrito anteriormente.

a, b Ejemplos típicos y resumen cuantitativo de la expresión del marcador de actividad Fos en neuronas colinérgicas (que expresan ChAT) de la NBM en ratones ingenuos y ratones con lesión nerviosa por constricción crónica (CCI) en presencia o ausencia de una baja intensidad ( 0,16 g) estímulo mecánico en la pata trasera contralateral. Barra de escala = 50 µm; n = 4 ratones/grupo; P < 0,05 (*0,0168, #0,0065), ANOVA de dos vías con pruebas de comparaciones múltiples de Sidak. c, d Esquema para la activación quimiogenética de neuronas colinérgicas NBM que expresan hm3D (Gq) con N-óxido de clozapina (CNO; c) y validación de su eficacia para aumentar la expresión de Fos en comparación con ratones que expresan mCherry en neuronas colinérgicas (control; d). dn = 3 ratones/grupo. e–g Comparación de respuestas nocifensivas inducidas por capsaicina (e) y el desarrollo de hipersensibilidad mecánica inducida por CCI (f) o hipersensibilidad térmica (g) entre ratones con activación quimiogenética de neuronas colinérgicas NBM y ratones de control (mCherry). Los valores de P en el recuadro (f) representan una comparación basada en ANOVA de las dos curvas completas de estímulo-respuesta. n = 5 ratones simulados y 6 hM3D(Gq); *P < 0,05 (0,0121 en e; 0,0178 y 0,0231, CCI día 7; 0,0151 y 0,0165, CCI día 11; 0,0209 CCI día 28 en f; <0,0001, CCI día 4; 0,010, CCI día 14 en g), dos ANOVA de manera con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Los datos se presentan como media +/- SEM.

Para probar la importancia funcional de estos hallazgos en el contexto de las condiciones de dolor neuropático, empleamos un enfoque quimiogenético para activar las neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal, que proporcionó dos ventajas: una, permitió apuntar a un área más grande que la estimulación optogenética (que es limitada). debido a la máxima área que puede ser suficientemente iluminada), y segundo, permitió lograr una activación más duradera de las neuronas colinérgicas. Los transgénicos ChAT-Cre se inyectaron con rAAV que expresa el activador quimiogenético excitatorio (mcherry-tagged hM3D(Gq)) o la proteína de control (mCherry) de una manera dependiente de Cre y se trataron con N-óxido de clozapina, que permite la activación inducible de hM3D( Gq)25 (figura 6c). La inmunohistoquímica dual para ChAT y Fos demostró que el 77 % de las neuronas colinérgicas en el NBM expresaron hM3D (Gq) y el 74 % demostró expresión de Fos con el tratamiento con CNO, mientras que menos del 5 % mostró expresión de Fos en ausencia de CNO (Fig. 6d), validando así la eficacia y la especificidad de la activación quimiogenética de las neuronas colinérgicas NBM. De acuerdo con los datos de los experimentos de optogenética, observamos que la sensibilidad nociceptiva inicial a la presión mecánica y al calor no se alteró; sin embargo, el comportamiento similar al dolor tónico inducido por la inyección plantar de capsiacina se redujo significativamente con la activación quimiogenética de las neuronas colinérgicas (Fig. 6e-g).

Luego empleamos el modelo de lesión por constricción crónica (CCI, por sus siglas en inglés) que involucra la ligadura suelta unilateral del nervio ciático, lo que lleva a una inflamación local e hinchazón del nervio, neuropatía e hipersensibilidad nociceptiva que dura hasta un mes26. La hipersensibilidad mecánica inducida por CCI se redujo notablemente en los ratones que expresaban hM3D (Gq) en comparación con los ratones que expresaban mCherry a partir del día 4 después de la cirugía de CCI (Fig. 6f). En el día 11, las respuestas mecánicas en los ratones que expresaban hM3D(Gq) eran indistinguibles de la sensibilidad inicial, mientras que los ratones que expresaban mCherry continuaron mostrando hipersensibilidad mecánica y recuperaron los valores iniciales solo el día 28 (Fig. 6f). De manera similar, la hipersensibilidad al calor se redujo significativamente en los ratones que expresaban hM3D (Gq) en comparación con los ratones que expresaban mCherry hasta el día 14 después de la CCI (Fig. 6g). Estos datos muestran que la activación del NBM suprime la hipersensibilidad neuropática durante un período prolongado.

La actividad de las neuronas NBM tiene el potencial de afectar el procesamiento del dolor directamente a través de la señalización colinérgica en objetivos neocorticales que son importantes en las redes de dolor, como lo indican nuestras observaciones anteriores sobre las neuronas de la capa 5 prefrontal. Sin embargo, debido a que se sabe que el NBM es un modulador clave de los circuitos subyacentes a la excitación y la atención20, también existe la posibilidad de que los efectos antihiperalgésicos observados estén relacionados con la atención y la expectativa. Por lo tanto, también abordamos si la estimulación optogenética de las neuronas colinérgicas NBM afecta el comportamiento de atención utilizando la prueba de tarea de reacción en serie de cinco opciones ampliamente aceptada (5-CSRT; Fig. 7a) en las mismas condiciones que se implementaron en ratones utilizados para pruebas nociceptivas en los experimentos. descrito en las Figs. 4–6. Durante 3 semanas, los ratones con restricción de agua fueron entrenados para aprender en tareas de condicionamiento operante para tomar decisiones correctas para recibir una recompensa de agua (Fig. 7a). La estimulación quimiogenética de las neuronas colinérgicas NBM mejoró significativamente la precisión de las reacciones y redujo la tasa de omisiones, lo que indica un mayor nivel de atención (Fig. 7b). Sin embargo, cuando estimulamos optogenéticamente las proyecciones NBM-PL en las mismas condiciones que se emplearon en los análisis del comportamiento similar al dolor, no hubo un impacto significativo en la precisión de las reacciones y la tasa de omisiones (Fig. 7c y Suplementario Fig. 5a, b), sugiriendo que la manifestación de la conducta antihiperalgésica no estaba relacionada per se con alteraciones atencionales. Sin embargo, es plausible que se pasara por alto una mejora potencial de la atención en los experimentos relacionados con las proyecciones NBM-PL debido a un efecto de techo en condiciones de referencia, y la situación puede ser diferente en un estado de dolor asociado con problemas de atención. Por lo tanto, probamos ratones con un comportamiento similar al dolor inflamatorio en la prueba 5-CSRT y observamos que todos los ratones muestran un aumento significativo en la tasa de omisión hasta 3 días después de la CFA en comparación con las condiciones iniciales (Fig. 7d). Sin embargo, la activación optogenética de las proyecciones NBM-PL en estos ratones no rescató los déficits de atención persistentes asociados con el dolor (Fig. 7d y la Fig. 5c complementaria) y el deterioro inducido por CFA se mantuvo independientemente de si la estimulación con láser estaba activada (Fig. 7d) o apagado (Fig. 5c complementaria) en ratones de control ChAT-Cre o Cre-negativos, lo que sugiere aún más que las proyecciones de NBM-PL inducen analgesia independientemente de la modulación de la atención.

un esquema de entrenamiento de ratones en tareas relacionadas con la atención en la prueba de tareas de reacción en serie de 5 opciones (5-CSRT). b, c Aumento de los parámetros relacionados con la atención en ratones con activación quimiogenética de neuronas colinérgicas en el NBM (b), pero no en ratones con activación optogenética de las proyecciones colinérgicas del NBM en el PL (c). n = 10 ratones/grupo (b); n = 6 ratones ChAT-Cre- y 8 ChAT-Cre+ (c); *P < 0,05 (pruebas de omisión, 0,0259; precisión, 0,0008), prueba t de dos colas pareadas. d Alteraciones en el comportamiento atencional tras la inducción de un comportamiento similar al dolor inflamatorio después de la inyección de CFA en la pata trasera en comparación con el comportamiento de referencia en presencia de estimulación con luz azul de las proyecciones colinérgicas de NBM-PL en ratones ChAT-Cre+ y ratones de control Cre-. N = 9 ratones ChAT-Cre- y 10 ChAT-Cre+; *P < 0,05 (Cre-, 0,0068; Cre+, <0,0001), ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. e–g Análisis del comportamiento relacionado con la ansiedad (superior en e, f, g) y la locomoción (inferior en e, f, g) en la prueba de campo abierto en ratones con activación quimiogenética (e) u optogenética (f) de colinérgico neuronas en el NBM o ratones con activación optogenética de las proyecciones colinérgicas del NBM al PL (g), en comparación con sus respectivos grupos de control. n = 6 ratones mCherry y 8 hm3D(Gq) (e); n = 7 ratones ChAT-Cre- y 8 ChAT-Cre+ (f); n = 6 ratones/grupo (g); *P < 0,05 (0,0182 para la puntuación de ansiedad en g), ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Los datos se presentan como media +/- SEM.

En segundo lugar, el NBM recibe entradas directas del CeA y está vinculado a circuitos neuronales de ansiedad y miedo27. Observamos que ni la quimiogenética directa (Fig. 7e) ni la estimulación optogenética de las neuronas NBM (Fig. 7f) indujeron comportamientos asociados al miedo en la prueba de campo abierto (la relación centro-margen no cambió). Por el contrario, las proyecciones NBM-PL estimulantes optogenéticamente redujeron la relación centro-margen en ratones ingenuos, lo que sugiere efectos ansiolíticos (Fig. 7g). Finalmente, la locomoción no cambió en todos los grupos que involucraron la modulación optogenética o quimiogenética de los circuitos NBM o NBM-PL, lo que sugiere una falta de efectos de confusión sobre la función motora en los análisis de comportamiento (Fig. 7e-g).

La literatura sobre el núcleo colinérgico del prosencéfalo basal y la percepción del dolor es sorprendentemente escasa. Hasta la fecha, menos de un puñado de estudios han probado la actividad del núcleo colinérgico del prosencéfalo basal ante la estimulación nociva28,29. En este estudio, ahora informamos la naturaleza precisa de los ritmos oscilatorios en el NBM, así como un análisis detallado a nivel de una sola célula in vivo, que muestra que el NBM no solo responde a estímulos nocivos, sino que también sufre cambios dinámicos durante la transición. a un estado similar al dolor crónico. La observación más interesante fue que el poder de la actividad oscilatoria gamma en el NBM se mejora específicamente junto con la estimulación nociva antes de la respuesta conductual. Las oscilaciones gamma en el S1 se han relacionado funcionalmente con la modulación nociceptiva en sistemas humanos y de roedores in vivo30,31, y estas alteraciones relacionadas con el dolor en la actividad gamma se han extendido recientemente a otras neocortezas, como las cortezas prefrontal e insular9,32 ,33. Este estudio, según nuestro conocimiento, representa el primer informe que vincula los ritmos gamma en una estructura subcortical con la sensibilidad nociceptiva. Es probable que se hayan pasado por alto en los estudios en humanos debido a las limitaciones técnicas de las grabaciones del cuero cabelludo.

Es importante destacar que nuestra observación de que en un modelo de dolor inflamatorio, el poder de la actividad gamma se potencia en respuesta a la estimulación táctil no nociva se correlaciona con la manifestación de alodinia mecánica e imita observaciones similares realizadas en la corteza S131. Tomado junto con el conocimiento actual, una implicación tentadora de nuestros hallazgos es que la actividad gamma en el NBM está funcionalmente vinculada a través de vías colinérgicas a las oscilaciones gamma neocorticales durante el procesamiento nociceptivo. Esto está respaldado por varios puntos conceptuales y observaciones experimentales. En primer lugar, un estudio reciente en ratas informó cambios hemodinámicos en el flujo sanguíneo en el NBM luego de una estimulación nociva y demostró que los cambios en el flujo sanguíneo cerebral en la corteza S1 ipsilateral provocados por estimulación nociva se redujeron significativamente al lesionar el NBM34, lo que sugiere la importancia del NBM en el manifestación completa de las respuestas relacionadas con el dolor en la corteza somatosensorial. En segundo lugar, tanto en S1 como en la corteza prefrontal, la señalización colinérgica facilita o incluso provoca directamente la actividad oscilatoria de la banda gamma a través de la modulación de las interneuronas GABAérgicas locales35,36, lo que mejora la agudeza del procesamiento de estímulos en las redes sensoriales y atencionales, aunque estos fenómenos no han sido estudiados. abordado en el contexto del dolor hasta ahora. Además, se ha propuesto que la actividad oscilatoria gamma coordina y vincula los estados de actividad en sitios distantes del cerebro, lo cual es un concepto particularmente digno de mención en el contexto del dolor8, ya que el dolor es esencialmente una función de red37,38.

Se atribuye un papel destacado en la aparición de la actividad oscilatoria gamma a las interneuronas GABAérgicas de pico rápido, que están ampliamente interconectadas a través de uniones comunicantes; no solo agilizan y sincronizan la salida excitatoria dentro de una región, sino que también son capaces de hacerlo en sitios distantes a través de proyecciones GABAérgicas de largo alcance, que típicamente hacen sinapsis en las neuronas GABAérgicas, lo que lleva a la desinhibición8,11. Es importante destacar que aquí observamos que, si bien diferentes conjuntos de neuronas NBM mostraron excitación o inhibición tras la estimulación nociceptiva, las neuronas NBM que experimentaron cambios significativos durante la transición a la hipersensibilidad nociceptiva se derivaron del análisis de forma de onda para ser neuronas GABAérgicas de pico rápido. En el NBM, una abrumadora mayoría de las neuronas colinérgicas son GABAérgicas11 y estas comprenden proyecciones de largo alcance al manto neocortical, lo que proporciona más credibilidad a la asociación entre los orígenes de la actividad oscilatoria gamma en el NBM y la modulación cortical del dolor. También observamos cambios en el rango de frecuencia beta de la actividad oscilatoria; sin embargo, se sabe mucho menos sobre sus orígenes celulares y su significado funcional para el dolor. Los estudios en sujetos sanos han informado que la actividad en las bandas de baja frecuencia, particularmente en los rangos alfa y beta, se suprime en las cortezas S1, prefrontal e insular en correlación con las calificaciones subjetivas del dolor9,39. Se necesitará más trabajo para desentrañar la importancia de los cambios en el ritmo beta en el NBM en los estados de dolor y si esto contribuye a los cambios en las oscilaciones beta en la neocorteza y de qué manera.

Nuestros análisis con el producto génico temprano inmediato inducido por actividad, Fos, sugieren que las neuronas colinérgicas del NBM se reclutan cada vez más en estados de dolor inflamatorio y neuropático, particularmente junto con estimulación sensorial. Este hallazgo, así como el perfil funcional general de las neuronas colinérgicas de NBM discutidas anteriormente, podrían igualmente argumentar a favor de un papel para el NBM en la modulación pronociceptiva o antinociceptiva. Aquí, dos modos independientes de activación de las neuronas colinérgicas NBM revelaron que el resultado neto de su activación es suprimir la hipersensibilidad nociceptiva. Un estudio previo sobre el daño a gran escala de las neuronas colinérgicas utilizando saporina conjugada administrada a través de inyecciones intracerebroventriculares informó una reducción del escape voluntario tanto del calor nocivo como del sonido estresante sin cambios en los comportamientos nocifensivos espinales, concluyendo que el afecto, pero no los comportamientos sensoriales, son modulados por neuronas colinérgicas del cerebro anterior40; sin embargo, esas conclusiones se basaron en la ablación generalizada en todo el cerebro, la toxicidad del parénquima y la pérdida de conectividad en una gran cantidad de áreas, incluido el hipocampo, la amígdala y la corteza. Aquí, las manipulaciones reversibles y específicas de la actividad de la célula, en lugar de la integridad neuronal, que se limitaron al NBM sugieren que el reclutamiento de neuronas colinérgicas del NBM cumple un papel protector general para limitar el dolor percibido. Debido a que las neuronas NBM se proyectan a diversos dominios neocorticales con diferentes funciones, así como a la amígdala, no se puede descartar que las conexiones individuales puedan desempeñar diferentes funciones. En este sentido, un estudio reciente que abordó un núcleo colinérgico diferente, a saber, el núcleo septal medial, informó que tanto la inhibición como la activación paradójicamente conducían a la supresión del comportamiento similar al dolor mediante efectos opuestos en la corteza cingulada anterior rostral y el CA1 del hipocampo ventral. región41. Aquí, la activación específica de las proyecciones de NBM a la corteza PL hizo un caso inequívoco para una función antinociceptiva, que estuvo acompañada por las observaciones de una orientación más densa de las proyecciones aferentes a la capa 5 y una expresión mejorada de Fos en las neuronas piramidales de la capa 5 de la PL. Como respaldo adicional, proporcionamos evidencia de que mejorar la salida de las neuronas PL de la capa 5 a través de la estimulación optogenética tiene un resultado antinociceptivo similar al de la estimulación de las conexiones NBM-PL. Nuestros datos indican que el PL muestra una mayor actividad en un estado similar al dolor inflamatorio, lo que es consistente con una mayor actividad oscilatoria en el NBM en el dolor inflamatorio. Es importante destacar que la actividad de las neuronas excitatorias de PL, pero no de las neuronas inhibidoras, se ve reforzada por la activación de la vía NBM-PL. Esta propiedad puede tener relevancia clínica, ya que se ha informado la desactivación del PL en algunos tipos de pacientes con dolor crónico15,19, así como en modelos de dolor neuropático en roedores16,17,18,19. En modelos de dolor neuropático, se ha demostrado que el aumento de la producción de PL, ya sea optogenéticamente24,42, farmacológicamente43 o mediante estimulación cerebral transcraneal no invasiva44, provoca analgesia. De hecho, los mecanismos que subyacen a la desactivación de la corteza prefrontal en el dolor crónico son un tema de intenso interés actual, con estudios que demuestran una mayor inhibición de la retroalimentación a través de la potenciación de las entradas de la amígdala en las neuronas GABAérgicas de pico rápido en el dolor neuropático17,24. Por el contrario, los aferentes colinérgicos entrantes del NBM, que se sabe que liberan conjuntamente GABA, tienen la capacidad de inhibir o desinhibir las neuronas piramidales neocorticales a través de la modulación directa frente a la modulación de las neuronas GABAérgicas locales, respectivamente. Nuestros resultados ahora muestran que las proyecciones colinérgicas-GABAérgicas del NBM al PL sirven para mejorar la actividad del PL a través de una mayor activación de las neuronas de proyección excitatoria, lo que podría ayudar a contrarrestar la desactivación del PL en estados de dolor neuropático. En apoyo, existe evidencia de un estudio ex vivo que muestra una reducción en la expresión sináptica de los receptores muscarínicos M1 excitadores en las neuronas de la capa 5 del PL en ratones neuropáticos45 y un estudio que informa la supresión de la alodinia neuropática tras la aplicación de un agonista M1-M4 en la región anterior. corteza cingulada46. Será interesante en estudios futuros diseccionar las contribuciones relativas de GABA y acetilcolina, que se liberan conjuntamente de los aferentes NBM-PL, en la modulación de la actividad del PL, por ejemplo, a través de la entrega regional de agonistas y antagonistas farmacológicos.

Debido a que el NBM cumple varias funciones diferentes, es importante moderar nuestras inferencias con interpretaciones alternativas. La modulación de la atención es una de las funciones mejor estudiadas del NBM20, que de hecho se confirmó en este estudio en ratones que recibieron estimulación optogenética directa de los somas neuronales colinérgicos del NBM. Se ha sugerido que la atención modula profundamente la percepción del dolor, por ejemplo, alterando la modulación descendente o mejorando la percepción del dolor mediante hipervigilancia47,48, lo que hace posible que los factores atencionales desempeñen un papel en la modulación del dolor por parte del NBM. Sin embargo, la activación selectiva de las proyecciones colinérgicas de NBM al PL fue insuficiente para modular la atención y la motivación y, por lo tanto, es poco probable que explique completamente los cambios en el comportamiento nocifensivo. En cambio, la activación mejorada de las neuronas PL de la capa 5 por la entrada aferente del NBM colinérgico-GABAérgico haría más plausible que la conectividad directa conocida de las neuronas piramidales de la capa 5 con el PAG18,24 conduzca a la modulación descendente de la nocicepción. La actividad motora o la actividad general no cambiaron, lo que sugiere que los efectos analgésicos observados fueron independientes de la excitación y la disfunción motora. Los posibles efectos ansiolíticos observados al estimular las proyecciones de NBM-PL son interesantes, ya que pueden resultar particularmente prometedores para abordar el miedo como una comorbilidad del dolor patológico49.

En total, los resultados de este estudio respaldan una mayor investigación del empleo de la modulación colinérgica en el tratamiento del dolor. Aunque se ha demostrado que los fármacos dirigidos a los receptores colinérgicos muestran eficacia en modelos preclínicos, la amplia gama de efectos secundarios impide la aplicación clínica. Los inhibidores de la acetilcolina esterasa, como la rivastigmina y la neostigmina, que potencian la biodisponibilidad de este neurotransmisor en los sitios donde se libera fisiológicamente, han mostrado eficacia clínica en varios estudios en dolor3,50. Por lo tanto, es imperativo delinear los lugares de acción, así como las alteraciones en los circuitos del dolor crónico que muestran la mayor promesa en términos de efectos beneficiosos y producen menos efectos secundarios. Usando electrofisiología in vivo de vanguardia y manipulaciones de circuitos específicos, este estudio demuestra que el NBM es un modulador importante de los circuitos involucrados en la percepción del dolor y que mejora directamente la actividad del NBM o sus proyecciones al PFC, por ejemplo, a través de diseños novedosos en técnicas de neuroestimulación, promete en el tratamiento de los trastornos de dolor inflamatorio y neuropático. En este sentido, cabe destacar que los NBM ya han sido implicados como un sitio potencial de acción de los anestésicos generales51.

Apuntar al NBM también puede ser una promesa terapéutica en el contexto de otros aspectos del dolor crónico que no se abordaron en este estudio. Por ejemplo, los cuadros de dolor crónico se acompañan frecuentemente de trastornos del sueño, que son patogénicos para empeorar su pronóstico y respuesta al tratamiento52,53. Se ha demostrado que la privación del sueño conduce a una conectividad reducida del NBM con la corteza prefrontal54. Además, se ha informado de pérdida neuronal en el NBM en trastornos como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, y durante el envejecimiento55,56,57,58. Los resultados de este estudio sugieren que el agotamiento neuronal en el NBM probablemente conducirá a una pérdida de los efectos moduladores antinociceptivos centrales, lo que contribuirá a los trastornos del dolor que se asocian con frecuencia con estos estados. Nuestra observación de la reducción de la actividad de NBM en etapas muy tardías después de la inflamación de la pata también es interesante a este respecto. El desarrollo y las pruebas en curso de la estimulación cerebral profunda del NBM56,58 son prometedores no solo para reducir el deterioro cognitivo, sino también para suprimir el dolor y restaurar el sueño normal en estos trastornos.

Los experimentos se realizaron en ratones Chat-IRES-Cre heterocigóticos machos y hembras de 2 a 8 meses de edad (B6; 129S6-Chattm2(cre)Lowl//Uhg59;) con antecedentes C57BL/6, y denominados aquí como ChAT-Cre ratones. Se utilizaron compañeros de camada Cre-(negativos) para los experimentos de control. Se usaron animales Rbp4-Cre machos y hembras de dos a cuatro meses de edad (B6.FVB/CD1-Tg(Rbp4cre)KL100Gsat/Uhg) con un fondo C57BL/6 para la orientación quimiogenética de las neuronas piramidales de la capa 5 en la corteza prelímbica. Se compraron animales machos y hembras C57BL/6J de 8 a 20 semanas de edad de Janvier Labs. Los animales se alojaron con comida y agua ad libitum en un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Se siguieron las pautas de ARRIVE. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las pautas éticas establecidas por el organismo de gobierno local (Regierungspräsidium Karlsruhe, Alemania; números de aprobación 35-9185.81/G44/17 y 35-9185.81/G184/18).

Los ratones se anestesiaron profundamente mediante inyección intraperitoneal de fentanilo (0,01 mg/kg), clorhidrato de medetomidina (0,3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg). Se aplicó lidocaína (10%) a la superficie de la piel y se perforó un pequeño orificio sobre la región de interés. La administración in vivo de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) se realizó mediante inyecciones estereotácticas. Las coordenadas NBM utilizadas en relación con el bregma fueron 0,35 mm posteriores, 1,6 mm laterales, a una profundidad de 4,55 mm desde la piamadre. El virus rAAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP (University of North Carolina Vector Core, EE. UU.) (250 nl) se administró durante 20 minutos sin diluir, mientras que rAAV5-Syn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry y rAAV5-Syn -Las soluciones virales de DIO-mCherry (Addgene Inc., EE. UU.) se diluyeron 1:1 en PBS y se inyectaron 400 nl durante 20 min. Los animales se mantuvieron durante al menos 3 semanas para lograr una expresión viral in vivo óptima antes de los experimentos conductuales y electrofisiológicos.

Para experimentos optogenéticos, se insertó un implante crónico de fibra óptica (200 µm de diámetro central, apertura numérica (NA) de 0,5) 100 µm por encima del sitio de la inyección viral en el NBM, o bilateralmente en la corteza del PL usando una rotación lateral de 15 ° (1,94 mm anterior desde bregma, 0,9 mm lateral, a una profundidad de 1,5 mm desde la pia), y fijado al cráneo con cemento dental y tornillo. La anestesia general se antagonizó con dosis intraperitoneales de Naloxona (Inresa Arzneimittel, Freiburg, Alemania; 0,4 mg/kg), Flumazenil (Fresenius, Bad Homburg, Alemania; 0,5 mg/kg) y Atipamezol (Prodivet Pharmaceuticals, Bélgica; 2,5 mg/kg) .

Para los experimentos electrofisiológicos, se implantaron dos tornillos de acero inoxidable en el cráneo por encima del cerebelo y la corteza sensorial derecha para que sirvieran como electrodos de tierra y de referencia, respectivamente. Luego se preparó una ventana craneal sobre el prosencéfalo basal izquierdo (AP = -0,35 mm, ML = 0,9 mm). Se extrajo la duramadre y se implantó versadrive-4 (Neuralynx), compuesto por cuatro tetrodos accionables independientemente (tungsteno, 12 μm de diámetro, California Fine Wire), en el prosencéfalo basal izquierdo a una profundidad inicial de 4,3 mm. La ventana craneal se cubrió con cera ósea y la configuración de versadrive-4 se fijó al cráneo con cemento dental.

Para la lesión por constricción crónica (CCI26), los ratones se colocaron bajo anestesia con isoflurano (2%) y se afeitó la piel del muslo derecho. Se hizo una incisión en la superficie lateral de la piel del muslo ya través del músculo bíceps femoral para exponer el nervio ciático justo por encima de sus ramificaciones en los nervios sural, peroneo común y tibial. Se colocaron cuatro ligaduras sueltas alrededor del nervio ciático usando suturas quirúrgicas de tripa de gato, el músculo y la piel posteriormente se suturaron y los animales se dejaron recuperar en una jaula calentada durante 24 h. Las pruebas de comportamiento comenzaron a partir del día 2 después de la operación. Se realizó la misma cirugía sin colocar las ligaduras del nervio ciático en animales de control simulados.

Los ratones se sujetaron de forma segura en un paño de algodón suave para unir los cables de conexión ópticos (fibras duales 0,5 NA conectadas a una junta rotatoria de fibra óptica con división de longitud de onda 1 × 2, Doric Lenses Inc., Canadá) a los implantes de fibra óptica. A su vez, la junta rotatoria de fibra óptica se acopló a través de un cable de conexión óptico (diámetro de núcleo de 200 µm, Thorlabs GmbH) a un láser de 473 nm (Shanghai Laser & Optics Century Co. Ltd, China). La intensidad del láser se fijó en 4 mW medida en la punta de la fibra con un fotómetro (PM100D, Thorlabs). La luz láser pulsada (20 Hz, duración del pulso de 10 ms) se aplicó normalmente durante 30 s, comenzando 15 a 20 s antes de los eventos de estimulación mecánica o térmica, o con cada evento de inicio de prueba en la prueba 5-CSRT, usando un generador de impulsos (n.º de cat. 33220 A, Meilhaus Electronic GmbH, Alemania).

Se realizaron pruebas de comportamiento durante el ciclo de luz de los animales. Los animales se sometieron a dos sesiones de aclimatación en las cámaras de instalación utilizadas para probar la sensibilidad mecánica o térmica. La sensibilidad inicial se evaluó durante varios días en tres sesiones de prueba antes de realizar cirugías CCI o inducir una inflamación de la pata mediante una inyección plantar subcutánea de 25 μl de adyuvante completo de Freund (CFA, Sigma-Aldrich) bajo anestesia breve con isoflurano. Se realizaron pruebas de comportamiento con animales que expresaban hM3D(Gq) y los correspondientes controles mCherry 1 h después de inyectar solución salina o N-óxido de clozapina (CNO, inyección intraperitoneal de 2 mg/kg; Biomol, Alemania). Los experimentadores siempre estaban cegados a la identidad de los grupos de tratamiento.

La capsaicina (Sigma) se diluyó a partir de una solución madre congelada de dimetilsulfóxido (DMSO, Thermo Fisher Scientific) (50X) con solución salina tamponada con fosfato (PBS, Thermo Fisher Scientific) para obtener una concentración de capsaicina del 0,02 % (peso/vol) en 2 % DMSO. Los animales se anestesiaron brevemente con isoflurano al 2% (Baxter, Alemania) y se inyectaron 20 µl de la solución de capsaicina con una aguja de 30 G por vía subcutánea en la superficie plantar de la pata trasera. Luego, los animales se colocaron en una caja transparente (20 × 20 cm) sobre una placa de vidrio acrílico, y un experimentador evaluó el tiempo total que el animal mostró un comportamiento nocifensivo (levantar la pata, lamer, estremecerse, retorcerse) durante un período de 5 minutos. ciego a la condición de tratamiento.

Después de la aclimatación a la configuración de von Frey (Ugo Basile Inc., Italia), se aplicó un conjunto de monofilamentos que se doblan con fuerzas de 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g, 0,6 g, 1,0 g y 1,4 g perpendicularmente en la superficie plantar de la pata trasera. Se aplicaron cinco aplicaciones por filamento con un intervalo mínimo de 1 min entre cada aplicación. En los experimentos de estimulación optogenética, el láser se encendió 20 s antes de aplicar el filamento y se apagó 10 s después de aplicar el estímulo mecánico. En total, se aplicaron cinco aplicaciones por filamento y por estado de láser durante una sesión de prueba para cada animal. Los ensayos se calificaron como positivos si el animal exhibió comportamientos de respuesta nocifensivos, incluido el retiro rápido de la pata, lamer o sacudir la pata, ya sea durante la estimulación mecánica o inmediatamente después de retirar el filamento. El umbral de retirada de la pata se determinó mediante el método up-down de Dixon60.

Se utilizó la configuración de prueba plantar de Hargreaves (Ugo Basile Inc., Italia) con una fuente de calor infrarroja (Modelo 37370-001, Ugo Basile) para probar los umbrales de abstinencia térmica aplicando calor radiante a la superficie plantar de la pata trasera. El nivel de intensidad se fijó en 25 y el tiempo de corte en 30 s. Se aplicó un estímulo de calor solo durante la fase de reposo y se registró la latencia de retirada desde el inicio del estímulo. Se realizaron seis ensayos por condición de tratamiento y animal en un día de prueba, utilizando un intervalo mínimo entre ensayos de 2 min. Los ensayos de encendido con láser se intercalaron aleatoriamente con ensayos de apagado con láser durante una sesión de prueba optogenética de Hargreaves. El láser se encendió 20 s antes de iniciar el estímulo térmico y se apagó 5 s después de una respuesta de retirada de la pata.

La prueba de campo abierto se realizó en una caja cuadrada (40 × 40 cm, 38 cm de altura) con una cámara USB colocada encima de la caja para rastrear los patrones de movimiento de los animales y registrar los parámetros experimentales utilizando el software ANY-maze (Stoelting Co. , Irlanda). Los animales no estaban aclimatados a esta configuración, por lo que encontraron un nuevo escenario para explorar. La caja se dividió en tres zonas para su análisis. Un borde de 3 cm de ancho a lo largo de las paredes de la caja se definió como la zona tigmotáxica. Se definió como zona central una zona cuadrada de 20 × 20 cm en el centro geométrico de la caja. El área restante se definió como la zona marginal. Cada ratón se colocó en el centro de la caja y se le permitió explorar todo el campo libremente durante un período de 8 min. La prueba de 8 min se dividió en períodos de 30 s con el láser encendido y apagado alternativamente en un tacto aleatorio para que cada ratón recibiera una iluminación total de 4 min. Durante la prueba, se registraron los parámetros de locomoción (distancia y velocidad media) dentro de cada segmento. La relación del tiempo pasado en el centro frente a las zonas tigmotáxicas se utilizó para evaluar el comportamiento similar a la ansiedad. La función motora se evaluó a partir de la distancia total recorrida en las tres zonas.

Tres cohortes de ratones ChAT-Cre que expresan hM3(Gq) DRADD (n = 10) o la opsina ChR2(H134R) (n = 8 y n = 10) en neuronas colinérgicas NBM, así como seis y nueve controles Cre-ve Los animales para los grupos de prueba optogenéticos fueron entrenados en la tarea de tiempo de reacción en serie de 5 opciones (5-CSRT) utilizando cámaras operantes automatizadas Bussey-Saksida Mouse Touch Screen (Campden Instruments, Loughborough, Reino Unido) y el software ABET II TOUCH (Lafayette Instrument, IN , EE.UU). A lo largo de las etapas de entrenamiento y prueba, los animales tenían acceso limitado al agua potable (30 minutos por día) y, por lo tanto, el agua podía usarse como recompensa para reforzar el comportamiento de elección correcto en los ensayos individuales durante la tarea. Para la habituación y el entrenamiento, se siguieron los procedimientos descritos en Humby61 y el módulo de tareas ABET II TOUCH 5-CSRT (versión 3). Brevemente, se presentaba una señal de luz en una de las cinco ventanas durante un período de tiempo determinado y se contaba como correcta una prueba si el animal tocaba el monitor de la ventana indicada dentro de un tiempo prolongado de 5 s después de que desaparecía la señal. Si el mouse interactuaba con otra ventana (prueba incorrecta) o no se detectaba interacción con la pantalla táctil (prueba de omisión) después de la presentación de la señal, se señalaba un período de tiempo de espera de castigo al encenderse la luz de la casa durante 5 s. Una sesión consistió en 60 ensayos y los ratones realizaron una sesión por día. La duración de la señal se redujo sucesivamente de 30 s a 1,4 s hasta que el rendimiento en cada etapa alcanzó un criterio de >80 % de precisión [número de intentos correctos/número total de intentos respondidos (correcto + incorrecto)] y <20 % de omisiones [número de intentos fallidos]. ensayos/número de ensayos presentados] durante dos días consecutivos. Los animales DREADD se probaron tres veces durante un período de 5 días con una duración de señal de 1,2 s después de haber recibido una inyección de solución salina o CNO. El período de presentación de señales se incrementó en 0,2 s en las sesiones de mantenimiento entre los días de prueba.

Los latiguillos ópticos se conectaron diariamente ya durante la última fase de entrenamiento de la cohorte optogenética sin encender el láser. Al alcanzar el criterio de rendimiento con señales mostradas durante 1,8 s, los animales fueron evaluados utilizando un período de presentación de señales de 1,6 s con el láser encendido al comienzo de cada prueba y APAGADO después de la recolección del premio de agua, o inmediatamente después de los 5 s extendidos. ventana de tiempo si no se detectó una respuesta táctil correcta. Después de establecer una línea de base mediante la prueba con o sin el láser encendido, una cohorte de ratones ChAT-Cre+ (n = 10) y Cre− (n = 9) recibió una inyección plantar subcutánea de 20 μl de CFA (consulte la sección de prueba de comportamiento anterior). ), y luego se probaron en días alternos con el láser encendido o apagado, en un orden semialeatorio. Se excluyeron los animales que tuvieron más del 30% de ensayos de omisión durante el período de referencia.

Al final del experimento, los ratones se sacrificaron con una sobredosis de dióxido de carbono y se perfundieron transcardiacamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguida de formalina al 10% (Merck, Alemania). Los cerebros se recogieron y se fijaron posteriormente durante 24 h a 4 °C. Las secciones del cerebro se cortaron con un vibratomo de 50 µm de espesor, se montaron con Mowiol y se tomaron imágenes con un microscopio fluorescente para confirmar la ubicación de los sitios de los electrodos o la inyección de AAV en animales Cre+.

Para evaluar los cambios en la actividad de las neuronas colinérgicas en condiciones dolorosas agudas e inflamatorias, los animales recibieron perfusión 90 minutos después de una inyección de capsaicina en la pata trasera, estimulación mecánica repetitiva (0,16 g de filamento, intervalo de 20 s durante un período de 10 minutos) de la pata inflamada el día 2 de CFA, y el día 4 a la pata ipsolateral de CCI y animales falsos. Para evaluar la actividad neuronal inducida por la estimulación optogenética, la luz láser pulsada se encendió cinco veces durante 30 s durante un período de 10 min en animales Cre+ y Cre- que luego se perfundieron 90 min más tarde. De manera similar, se inyectó CNO o solución salina en animales DREADD 2 h antes de la perfusión.

Se utilizó inmunomarcaje dual con anti-Fos (conejo; ab190289, Abcam, Reino Unido) y anti-ChAT (cabra; AB144P, Merck) a 1:1000 y 1:250, respectivamente. Brevemente, las secciones se incubaron en PBS/glicina 50 mM durante 10 min, seguido de un paso de bloqueo de 60 min en suero de caballo al 4 % con Triton al 0,2 % en PBS. Las secciones se incubaron con ambos anticuerpos primarios en la solución de bloqueo durante 24 h a 4 °C. Posteriormente, las secciones se lavaron en una solución de bloqueo (tres lavados de 10 min) y se incubaron con una mezcla de anticuerpos secundarios de burro anti-conejo-Alexa-488 y burro anti-cabra-Alexa-633 (Invitrogen, EE. UU.; 1:700 cada uno) en solución de bloqueo durante 2 h a temperatura ambiente. Donkey anti-rabbit-Alexa-594 se usó para cerebros con expresión de EYFP inducida por AAV. Para mejorar la fluorescencia de EYFP de los terminales NBM transducidos por AAV, se inmunomarcó un subconjunto de secciones frontales del cerebro con un cóctel de anti-Fos de conejo (1:1000) y anti-GFP de pollo (ab13970, Abcam; 1:1000, preincubado primero durante 72 h a 4 °C a una dilución 1:100 con secciones de cerebro de ratones C57bl6 ingenuos) anticuerpos primarios (48 h de incubación a 4 °C), utilizando burro anti-conejo-Alexa-594 y cabra anti-pollo-Alexa-488 (Invitrogen, EE. UU.; 1:700 cada uno) anticuerpos secundarios (como arriba, incubados durante 2 h a temperatura ambiente). Los tejidos se lavaron dos veces en PBS, se incubaron en Hoechst 33342 (diluido 1:10 000 en PBS de una solución madre de 10 mg/ml, Invitrogen) durante 10 min, se lavaron de nuevo en PBS y se incubaron durante 10 min en TRIS-HCl 10 mM antes de montaje.

Además, se realizaron dos series de experimentos de marcación inmunohistoquímica triple con anti-Fos de conejo (Abcam, 1:1000), antisomatostatina de rata (EMD Millipore, 1:300) y antiparvalbúmina de cobayo (Swant, 1:500). ), o anti-Fos de conejo (Abcam, 1:1000), anti-Ctip2 de rata (Abcam, 1:500), y anti-SATB2 de conejillo de indias (Synaptic Systems, 1:200). Las secciones se procesaron como se describe anteriormente para el procedimiento de inmunotinción dual y se incubaron durante 48 h a 4 °C. Los anticuerpos secundarios utilizados fueron burro anti-conejo IgG Alexa-488, burro anti-rata IgG Alexa-594 y cabra anti-conejillo de indias IgG Alexa 647 (todos Invitrogen, 1:700). La especificidad de la tinción de anticuerpos se probó omitiendo los anticuerpos primarios.

Se tomaron imágenes de las secciones utilizando un microscopio confocal de escaneo láser (Leica TCS SP8, Alemania) con una resolución de píxeles de 1024 × 1024. Los parámetros de iluminación se mantuvieron de manera idéntica para una serie de imágenes en todos los animales. Se utilizó un objetivo de aire seco (Leica, 10×/0,40, HC PL APO) para obtener imágenes de las secciones marcadas con Fos y un objetivo de inmersión con collar de corrección (Leica, 20×/0,75, HC PL APO) para obtener imágenes de las secciones con triple etiqueta. Se adquirió un montaje de pilas de imágenes confocales sobre una profundidad de 25 µm centrada sobre la región de interés en el nivel medio de cada sección y se aplicó la máxima proyección z de imágenes para el conteo en el software ImageJ (versión 1.50b, National Institutes de Salud, EE.UU.). El atlas62 estereotáxico de cerebro de ratón y el atlas de referencia del Allan Institut (2011) se usaron respectivamente para definir la región de interés y los contornos de la capa cortical de acuerdo con las secciones de referencia correspondientes. Las células marcadas con Fos, doble y triplemente marcadas dentro de cada región de interés se contaron manualmente usando la misma configuración de contraste y umbral para todas las secciones dentro de un grupo experimental. Se excluyeron las células positivas situadas en el límite. Los recuentos de células se convirtieron para indicar el número de células positivas en el volumen de la pila de imágenes dentro de la región de interés (células/mm3).

Se usó una región de interés (tamaño mediolateral de 1,5 mm × dorsoventral de 1,0 mm) como marco de conteo por encima de la región NBM con la expresión más alta de neuronas ChAT+ o EYFP+. El borde inferior del globo pálido se utilizó como límite superior. Las células con doble y triple marca Fos+ dentro del marco de conteo en ambos hemisferios se contaron manualmente utilizando los mismos ajustes de contraste y umbral para todas las secciones dentro de un grupo experimental. Los recuentos de neuronas Fos+ doblemente marcadas del grupo de tratamiento con capsaicina son promedios de tres secciones del cerebro expresadas como % de neuronas ChAT+ en cada hemisferio. Como el número de neuronas Fos+ marcadas doble y triplemente no difirió significativamente entre los hemisferios para todos los demás grupos de tratamiento, los datos de los dos hemisferios se promediaron para cada corte de cerebro y se convirtieron para indicar el número de células positivas en el volumen de la pila de imágenes. dentro de la región de interés (células/mm3).

Después de una semana de recuperación de la cirugía de implantación, los tetrodos se redujeron 0,5 mm en promedio en la región de interés y permanecieron sin cambios hasta el final del experimento. A los ratones se les permitió 2 días para habituarse a la rejilla elevada de la configuración de grabación de la prueba de von Frey. Se realizaron pruebas de sensibilidad mecánica ingenua con filamentos débiles (0,07 gy 0,6 g) y fuertes (0,6 gy 1,0 g) durante 4 días. Cada filamento se aplicó diez veces en la superficie plantadora de la pata trasera derecha con un intervalo mínimo de 60 s entre las pruebas de estimulación. Se indujo inflamación crónica inyectando solución de CFA (25 µl, adyuvante completo de Freund, Sigma) por vía subcutánea en el lado plantar de la pata trasera derecha. Las pruebas de nocicepción mecánica se realizaron los días 1, 2, 3, 4, 7, 9, 12, 14 después de la inyección de CFA con los mismos filamentos utilizados para las pruebas de referencia. Al final de los experimentos de comportamiento, los ratones se anestesiaron profundamente con isoflurano al 2 %, se marcó la ubicación de cada punta de tetrodo aplicando corriente eléctrica para inducir una pequeña lesión y los animales se perfundieron transcardiacamente para fijar el tejido cerebral.

Las señales neuronales se adquirieron a través de un escenario frontal HS-18-MM utilizando el sistema Digital Lynx 4SX y el software de adquisición de datos Cheetah (Neuralynx). Los datos sin procesar se adquirieron a 32 kHz con un filtro de paso de banda (1–6000 Hz). La estimulación de von Frey se registró con un transductor piezoeléctrico hecho a medida (elemento cerámico piezoeléctrico, n.° de pieza 717770, Conrad), que transdujo la presión de la estimulación de von Frey en una señal analógica filtrada a 1–2000 Hz31. Además, los videos de eventos de estimulación mecánica fueron grabados por una cámara USB (20 cuadros/segundo), sincronizados a través de una señal de evento generada por teclado con la señal piezoeléctrica. El inicio de la estimulación se definió como el tiempo de contacto del filamento de von Frey con la pata trasera correspondiente a una desviación inicial de la señal piezoeléctrica al inspeccionar visualmente las grabaciones de video y piezoeléctricas, respectivamente.

El potencial de campo local (LFP) y la actividad de una sola unidad se analizaron con scripts personalizados utilizando MATLAB63 (The Mathworks Inc, versión R2014a). El análisis estadístico y las pruebas post hoc se realizaron en Graphpad Prism (versión 9).

Para el análisis de espectrograma de la actividad de LFP, se extrajeron de los datos sin procesar 3 s antes y 3 s después del inicio de la aplicación del filamento de von Frey para los ensayos de retirada. Se analizó un canal de un tetrodo por animal. Los episodios de datos sin procesar se filtraron con un filtro Chebyshev tipo I de paso bajo de tercer orden con ondas de 0,5 dB en la banda de paso y una frecuencia de borde de banda de paso de 200 Hz y muestreada a 1000 Hz. Los espectrogramas de potencia se generaron con la función de ondículas de Morlet, estableciendo la frecuencia central en 0,8125 Hz, la precisión de frecuencia en 0,5 Hz y la resolución de tiempo en 1 ms. El período de referencia de 1 s antes del inicio de la estimulación se utilizó para normalizar cada segmento de frecuencia de 0,5 Hz por la media respectiva y se expresó como % de desviaciones con respecto a la línea de base previa a la estimulación. A continuación, se promediaron los espectrogramas de potencia normalizados de los ensayos individuales para filamentos débiles y fuertes para cada ratón y día. Los grandes promedios medios de estos espectrogramas normalizados para todos los animales se muestran en las Figs. 1e, 2c y Fig. 3a complementaria.

Para el análisis cuantitativo, los promedios de cuatro bandas de frecuencia, incluidos theta (4 a 8 Hz), alfa (8 a 14 Hz), beta (14 a 30 Hz) y gamma (30 a 100 Hz), en los espectrogramas de potencia de cada animal se calcularon durante todo el período de postestimulación de 2 s. Para el análisis del curso del tiempo, los espectrogramas normalizados de cada animal se agruparon en contenedores de 100 ms y se calcularon los promedios para cada banda de frecuencia. Se calculó como referencia la mediana del tiempo de espera de los ensayos correspondientes para un espectrograma. Para correlacionar la fuerza del filamento individual con el aumento en la potencia del espectrograma, se promedió la potencia normalizada durante los 2 s posteriores a la estimulación para cada filamento y banda de frecuencia para cada animal.

La clasificación de picos se realizó con Kilosort264 para aislar unidades individuales. Los datos sin procesar se preprocesaron con un filtro de paso de banda de 300 a 6000 Hz. La corrección de deriva, el agrupamiento de unidades y la coincidencia de plantillas se realizaron automáticamente en función del método de coincidencia de plantillas. Las unidades agrupadas automáticamente se seleccionaron manualmente en Phy (versión 2.0; https://github.com/cortex-lab/phy) utilizando características de agrupación y similitud de forma de onda, tasa de disparo, así como funciones de correlación cruzada y autocorrelación.

Para el análisis de los cambios de actividad evocados en los datos de una sola unidad, la actividad de activación de cada prueba de retiro se alineó con el inicio de la estimulación para las pruebas de retiro de todos los filamentos o por separado para los grupos de filamentos débiles y fuertes. Se calculó la tasa de activación en los ensayos para intervalos de 250 ms y las puntuaciones z se calcularon en función de la media y la desviación estándar de las actividades de referencia previas a la estimulación de 3 s44. Se identificaron las unidades que mostraban una actividad significativamente mayor o menor si al menos uno de los intervalos normalizados en el período posterior a la estimulación de 3 s excedía 3,09 o −3,09, respectivamente, lo que corresponde a un nivel de significación de P < 0,001. De lo contrario, la unidad se clasificó como una unidad que no responde. Las unidades se excluyeron de este análisis si la tasa de descarga media era inferior a 1 Hz o el número de intentos de retirada era inferior a 3. Para comparar la magnitud de las respuestas provocadas por la estimulación, se extrajo la puntuación z máxima y mínima de todas las unidades. con tasas de disparo significativamente aumentadas o disminuidas dentro de los períodos posteriores a la estimulación de 3 s, respectivamente.

Para la clasificación de una sola unidad, se calcularon varios parámetros, entre ellos: tasa de disparo, coeficiente de variación de los intervalos entre picos, amplitud pico a pico de la forma de onda, tiempo entre los picos tempranos y tardíos de la forma de onda, tiempo desde el punto mínimo de la forma de onda hasta el regreso a línea de base y asimetría de la forma de onda (el cociente de la diferencia entre la línea de base y el pico temprano y el pico tardío y el retorno de los tiempos de la línea de base, a la suma de estos dos tiempos). Estos parámetros multidimensionales se proyectaron en dos dimensiones utilizando la función Matlab t-SNE (incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t)65. Luego se aplicó el algoritmo k-means para agrupar estas unidades en dos grupos. Con base en la separación de grupos, la mejor clasificación de unidades se logró utilizando solo dos parámetros de forma de onda: el parámetro de asimetría y el tiempo desde el punto mínimo hasta el regreso a la línea de base. No intentamos distinguir si las unidades que clasificamos eran neuronas excitatorias o inhibitorias, ni podemos distinguir entre neuronas de proyección e interneuronas.

Todos los datos se expresan como media ± SEM. a menos que se diga lo contrario. Prism (versión 9) se utilizó para el análisis estadístico de todos los datos de comportamiento y para realizar pruebas de comparación post hoc de conjuntos de datos electrofisiológicos. Se realizó una prueba t de una muestra para detectar si las bandas de frecuencia específicas del espectrograma de potencia LFP de las pruebas de abstinencia se desviaban significativamente de la línea de base previa a la estimulación. Se utilizó el método ROUT con Q = 0,5 % para probar los valores atípicos. Se utilizó un ANOVA unidireccional de medidas repetidas con la prueba de comparación múltiple de Dunnett para las diferencias con la línea de base previa a la estimulación para el análisis de la evolución temporal en la Fig. 1g y la Fig. 1b complementaria. Todos los conjuntos de datos agrupados se analizaron con un ANOVA de dos vías usando la prueba de Sidak para comparaciones múltiples para combinaciones de tratamiento relevantes que tenían efectos significativos en el grupo principal. Se usó la prueba t de Student no pareada para evaluar los efectos del tratamiento en comparación con un grupo de control. Se aplicó la prueba de contingencia Chi-cuadrado para los tipos de respuesta unitaria (Fig. 2b complementaria) para todos los períodos de tiempo, así como para combinaciones de períodos de tiempo por pares para detectar el conjunto de datos que se desvía. En todas las pruebas, se consideró significativo un valor de p <0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de electrofisiología generados en este estudio se han depositado en el repositorio heiDATA con el código de acceso [https://doi.org/10.11588/data/ET9G9X]. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Los scripts de Matlab para analizar datos electrofisiológicos están disponibles junto con los datos sin procesar en el mismo repositorio [https://doi.org/10.11588/data/ET9G9X].

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Los autores agradecen a C. Gartner por la asistencia de secretaría ya N. Gehrig, V. Buchert, D. Baumgartl-Ahlert y B. Zimmermann por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por Deutsche Forschungsgemeinschaft a RK en forma de subvenciones en el consorcio de dolor crónico CRC1158 (Proyecto B01, B06). MO recibió una subvención semilla de los fondos CRC1158. Los autores agradecen el apoyo de becas para ZG del Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, para HL del China Scholarship Council y PVN de Studienstiftung des Deutschen Volkes (Programa de mérito nacional alemán), así como una carrera científica joven. beca de fondos CRC1158. Los autores agradecen al Centro Interdisciplinario de Neurocomportamiento de la Facultad de Medicina de Heidelberg por su ayuda con los experimentos de comportamiento y el servicio de almacenamiento de datos (SDS@hd) apoyado por el Ministerio de Ciencia, Investigación y Artes de Baden-Württemberg (MWK) y la Fundación Alemana de Investigación. (DFG) mediante concesión INST 35/1314-1 FUGG e INST 35/1503-1 FUGG.

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina de Heidelberg, Universidad de Heidelberg, Im Neuenheimer Feld 366, 69120, Heidelberg, Alemania

Manfred J. Oswald, Yechao Han, Han Li, Samuel Marashli, Deniz Nouri Oglo, Bhavya Ojha, Paul V. Naser, Zheng Gan y Rohini Kuner

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MO, YH, ZG, HL, DU, BO, SM y PVN realizaron todos los experimentos húmedos bajo la supervisión de RKMO y ayudaron con la planificación y ejecución de protocolos de electrofisiología. RK conceptualizó el proyecto, y todos los autores proporcionaron aportes conceptuales regulares. MO, HL y ZG prepararon las figuras. RK escribió el manuscrito y todos los autores proporcionaron comentarios e información metódica al escribir el manuscrito y presentar los datos.

Correspondencia a Rohini Kuner.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Patrick Sheets y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Oswald, MJ, Han, Y., Li, H. et al. El núcleo colinérgico del prosencéfalo basal de Meynert regula el comportamiento similar al dolor crónico a través de la modulación de la corteza prelímbica. Nat Comun 13, 5014 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32558-9

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Recibido: 29 enero 2022

Aceptado: 03 agosto 2022

Publicado: 25 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32558-9

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