Cerebro

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3417 (2022) Citar este artículo

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A pesar de la importancia fundamental de comprender el diagrama de cableado del cerebro, nuestro conocimiento de cómo se reconfigura la conectividad neuronal por una lesión cerebral traumática sigue siendo notablemente incompleto. Aquí utilizamos imágenes de todo el cerebro de resolución celular para generar mapas de todo el cerebro de la entrada a las neuronas inhibitorias en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática. Encontramos que las interneuronas de somatostatina se convierten en centros hiperconectados en múltiples regiones del cerebro, con ricas conexiones de red local pero entradas de largo alcance disminuidas, incluso en áreas que no están directamente dañadas. La pérdida de entrada de largo alcance no se correlaciona con la pérdida de células en regiones distantes del cerebro. Las interneuronas trasplantadas en el sitio de la lesión reciben información ortotópica local y de largo alcance, lo que sugiere que la maquinaria para establecer conexiones distantes permanece intacta incluso después de una lesión grave. Nuestros resultados descubren una estrategia potencial para mantener y optimizar la inhibición después de una lesión cerebral traumática que implica la reorganización espacial de las entradas directas a las neuronas inhibitorias en todo el cerebro.

La función cerebral se basa en un grupo extremadamente diverso de interneuronas inhibitorias que controlan la entrada y salida de las redes locales1,2,3. En la corteza cerebral, una de las mayores poblaciones de interneuronas expresa el neuropéptido somatostatina (SST)4,5,6. Estas células inhiben las dendritas y, por lo tanto, regulan la integración de la entrada glutamatérgica a las neuronas principales locales. Esto les otorga funciones únicas en la configuración de la plasticidad sináptica, el aprendizaje y la memoria7,8,9,10,11,12,13,14. Sin embargo, las interneuronas SST se encuentran entre las más vulnerables a la muerte celular después de una lesión cerebral, y su pérdida ha sido bien documentada en modelos experimentales de epilepsia, lesión cerebral traumática (TBI) y enfermedad de Alzheimer15,16,17,18,19, y en humanos20,21. En el hipocampo, las interneuronas SST supervivientes reciben más impulso excitatorio, forman nuevas sinapsis inhibidoras en las neuronas glutamatérgicas e incluso crecen en territorios que normalmente no ocupan22,23,24,25. Este patrón de recableado de circuitos locales plantea la cuestión de si el daño cerebral reorganiza la conectividad interneuronal a una escala mucho mayor.

Para abordar esta posibilidad de manera imparcial, aprovechamos un sistema de virus de la rabia monosináptico retrógrado y técnicas mejoradas de limpieza de tejido cerebral completo para crear mapas de todo el cerebro de la entrada directa a las interneuronas SST en un modelo de ratón de TBI focal. Encontramos diferencias cuantitativas dramáticas en la entrada local y de largo alcance a las interneuronas SST del hipocampo en el sitio de la lesión. Sin embargo, no hubo pérdida de neuronas dentro de las propias regiones de entrada distantes, y la proporción de subtipos de neuronas dirigidas a las neuronas iniciadoras se mantuvo estable. Para nuestra sorpresa, descubrimos un patrón similar de reorganización del circuito lejos de la lesión en la corteza prefrontal (PFC), que interactúa con el hipocampo bidireccionalmente26 pero que no resultó dañado directamente por la lesión inicial. Los progenitores de interneuronas injertados en el hipocampo lesionado establecieron con éxito conexiones apropiadas de largo alcance; sin embargo, las interneuronas derivadas del injerto retuvieron la entrada local mejorada observada después de la TBI. Por lo tanto, nuestros experimentos brindan nuevos conocimientos sobre la remodelación de circuitos a gran escala después de una lesión cerebral y sugieren que el daño cerebral, incluso cuando está restringido focalmente, tiene un impacto mucho más amplio en la función del circuito neuronal en todo el cerebro de lo que se había apreciado anteriormente.

A pesar de su importante papel en la configuración de la memoria y la actividad de la red local11,14, la entrada precisa de todo el cerebro a las interneuronas SST en la circunvolución dentada no se ha definido sistemáticamente. Primero cuantificamos la densidad de neuronas SST + durante el período crónico después de TBI usando ratones informadores que etiquetan casi todas las interneuronas SST con GFP27. Se administró una lesión de impacto cortical controlado unilateral (CCI) a ratones adultos jóvenes en P60 (profundidad de impacto de 1,0 mm, 3,5 m s−1 y 500 ms de duración), y los animales se procesaron para inmunotinción ocho semanas después. Este período corresponde a un momento en que la neuropatología a largo plazo y los fenotipos conductuales están bien establecidos. En todos los ratones con lesión cerebral, la lesión consistía en una cavidad que se extendía a través del espesor de la neocorteza e incluía una distorsión y adelgazamiento sustanciales de las principales capas de células en el hipocampo (Fig. 1a). Observamos una reducción de ~65 % en las células GFP+ en el hilio (Fig. 1b; Datos complementarios 1), consistente con la pérdida a corto plazo de interneuronas SST informada en estudios previos17,18.

una sección coronal 8 semanas después de TBI etiquetada para SST-GFP (verde) y DAPI (magenta). h, hilio; gcl, capa de células granulares; ml, capa molecular. Animal representativo de n = 5 ratones TBI b Cuantificación de interneuronas SST-GFP en animales de control no lesionados y animales con lesiones cerebrales. ***P = 1,62E-06, control no lesionado ipsilateral versus TBI ipsilateral, ***P = 1,31E-05, TBI contralateral versus TBI ipsilateral; ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de Tukey, n = 6 ratones ilesos y 5 TBI. C. Esquema que muestra la estrategia de rastreo retrógrado experimental de dos virus. d, e Giro dentado de un control ileso (d) y un animal lesionado por CCI (e) etiquetados para DAPI (azul), virus auxiliar AAV (verde) y RVΔG-mCherry (magenta). Animales representativos de n = 4 ratones ilesos y 2 TBI. F. Sección coronal de la circunvolución dentada marcada para el virus auxiliar AAV (verde) y somatostatina (magenta). Animal representativo de n = 3 ratones ilesos. g Cuantificación de la expresión de SST en neuronas marcadas con virus auxiliar AAV; n = 3 ratones. h Distribución de células iniciadoras marcadas con dos colores en el hipocampo; n = 73 células de 4 controles ilesos, n = 23 células de 2 animales con TBI. Barras de error, sem; barras de escala, 1 mm (a, izquierda), 100 μm (a, derecha; d y e) y 50 μm (f). Véanse también las figuras complementarias. 1, 2 y Datos complementarios 1. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para etiquetar la entrada monosináptica a las interneuronas SST en el cerebro con lesión crónica, utilizamos un enfoque de dos virus genéticamente restringido para revelar anatómicamente sus supuestas entradas (Fig. 1c-e). Primero inyectamos un virus auxiliar dependiente de Cre (AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-eGFP-2A-oG) en la circunvolución dentada de ratones adultos SST-Cre 4 semanas después de TBI. Este virus auxiliar proporciona el receptor que permite que el virus de la rabia recubierto con EnvA ingrese solo a las neuronas Cre positivas y la glicoproteína para que el virus de la rabia se transfiera de manera retrógrada a las neuronas de entrada monosinápticas. Tres semanas más tarde, inyectamos un virus de la rabia con eliminación de G y pseudotipado de EnvA que codifica mCherry en la misma ubicación (RVΔG-mCherry). Debido a que las interneuronas SST+ en la circunvolución dentada se encuentran exclusivamente en el hilio, nos dirigimos a esta región para la inyección de virus. Después de 7 días, identificamos las neuronas que dieron positivo para ambos indicadores fluorescentes en el lugar de la inyección (células iniciadoras) y las neuronas infectadas con el virus de la rabia se etiquetaron con mCherry (neuronas de entrada presinápticas). Un número sustancial de neuronas en diferentes áreas del cerebro fueron marcadas por el virus de la rabia (Fig. 1 complementaria).

Para confirmar la especificidad del etiquetado del virus, realizamos inmunotinción contra SST en el sitio de inyección. Encontramos que el 97% de las neuronas marcadas con GFP eran SST + (152 de 156 células, n = 3 ratones) (Fig. 1f, g). Para evaluar la posible fuga de expresión del virus, realizamos una serie de experimentos de control. Para confirmar la dependencia de la recombinación Cre, inyectamos el ayudante AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-eGFP-2A-oG y el virus RVΔG-mCherry en compañeros de camada Cre. No se etiquetaron neuronas en ninguna parte del cerebro (Fig. 2a complementaria). En los animales Cre+, las neuronas GFP+ solo se marcaron en el sitio de la inyección y no se encontraron neuronas GFP+ fuera del sitio de la inyección (Fig. 2 complementaria). Tanto en los animales de control como en los animales con lesión cerebral, las células iniciadoras se limitaron casi exclusivamente al hilio (Fig. 1h, Datos complementarios 1). Solo se encontraron células iniciadoras ocasionales en la región CA3 adyacente; no se encontraron células GFP+ en CA1, CA2, neocortex o cualquier otra región del cerebro.

A continuación, generamos mapas de todo el cerebro de las neuronas que envían entradas monosinápticas a las interneuronas SST mediante la limpieza del cerebro de iDISCO+ y las imágenes de láminas de luz de todo el cerebro (Fig. 2a). Uno de los principales desafíos de estas técnicas ha sido acceder a las neuronas de entrada en lo profundo del tejido28. Sobre la base de los protocolos iDISCO+ existentes y los avances recientes en la química de permeabilización29,30, modificamos las condiciones de limpieza para lograr el inmunomarcaje de tejido profundo en un cerebro con lesión traumática. Realizamos tres mejoras clave en los procedimientos de obtención de imágenes y preparación de muestras de iDISCO+ (Fig. 3 complementaria). Primero, incorporamos un lavado inicial con N-metil dietanolamina (MDEA) para decolorar la sangre residual no perfundida, que absorbe la luz31. En segundo lugar, desnaturalizamos la matriz extracelular utilizando una solución concentrada de clorhidrato de guanidina antes del inmunomarcaje. En tercer lugar, incorporamos un detergente adicional (3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato, CHAPS) al diluyente de anticuerpos para mejorar la penetración de anticuerpos más profundamente en el tejido. Estas optimizaciones permitieron el inmunomarcaje de todo el cerebro sin necesidad de separar los cerebros en dos hemisferios separados, como se hace comúnmente. Los datos sin procesar adquiridos de las imágenes se registraron en Allen Common Coordinate Framework (CCF) y las posiciones de las celdas se anotaron y analizaron utilizando herramientas de la suite BrainGlobe32,33 (Fig. 4 complementaria). Como era de esperar, el número de neuronas iniciadoras se redujo en animales con lesión cerebral (control: 48,0 ± 3,7 células, TBI: 9,4 ± 0,9 células, P = 9,45E-06, prueba t de dos colas), en consonancia con la pérdida de interneuronas SST. Las células iniciadoras se limitaron casi exclusivamente al hilio (control: 92,8 ± 0,96 % de células iniciadoras en la circunvolución dentada, TBI: 89,8 ± 3,2 % de células iniciadoras en la circunvolución dentada; P = 0,3, prueba exacta de Fisher). Aunque la cantidad de neuronas marcadas varió de un animal a otro, hubo una correlación entre la cantidad de neuronas de entrada y las células iniciadoras (Fig. 2b).

un diseño experimental para la limpieza cerebral iDISCO+ mejorada y la formación de imágenes de láminas de luz de todo el cerebro. b Análisis de regresión lineal para el número de células iniciadoras y neuronas de entrada presinápticas en todo el cerebro (n = 4 controles ilesos, 5 ratones TBI; R2 = 0,98). c Secciones coronales esquemáticas (250 μm) que muestran células individuales marcadas con rabia registradas en el espacio de atlas estandarizado para controles no lesionados (azul) y animales con lesiones cerebrales (rojo). Un punto representa una neurona. n = 4 animales control ilesos y 5 TBI. Se proporciona una lista de abreviaturas en Datos complementarios 2. d Gráficos de densidad de células del núcleo gaussiano que muestran las distancias euclidianas agrupadas de las neuronas de entrada al centroide de la neurona iniciadora más cercana. mi. Proporción de neuronas de entrada que se encuentran fuera del hipocampo ipsilateral (DG, CA3, CA2, CA1). Sin lesiones: 39,6 ± 5,2 %, n = 4 ratones; TBI: 11,8 ± 2,7 %, n = 5 ratones; **P = 1,5E-3; prueba t de dos colas. f Proporción de neuronas de entrada que se encuentran en el hemisferio contralateral. ilesos: 8,4 ± 0,7 %, n = 4 ratones; TBI: 3,0 ± 0,8 %, n = 5 ratones; **P = 2,0E-3; prueba t de dos colas. g Gráfica de densidad de células kernel gaussiana de la distribución de neuronas de entrada en todo el cerebro a lo largo del eje anterior-posterior. El sombreado gris representa la población agrupada con líneas individuales que representan a cada animal. La cuantificación se proporciona en Datos complementarios 3. h Proporción de neuronas de entrada encontradas en cada área discreta del cerebro. ***P < 1,0E-15, ileso frente a TBI (CA1), ***P = 2,25E-04, ileso frente a TBI (ENTm), **P = 4,69E-03, ileso frente a TBI (NDB); ANOVA bidireccional de medidas repetidas con la prueba post-hoc de Bonferroni; n = 4 ratones ilesos y 5 TBI. La cuantificación se proporciona en Datos complementarios 4. Barras de error, sem; barras de escala, 1 mm (excepto inmunomarcaje profundo en a, 100 μm). Véanse también las figuras complementarias. 3 a 7, Datos complementarios 5 y Películas complementarias 1 y 2. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El mapeo de todo el cerebro de las neuronas marcadas con rabia reveló información de 15 regiones cerebrales distintas (Fig. 2c, Figs. Suplementarias 5, 6). La mayor parte de la entrada provino de la circunvolución dentada y CA3, como se esperaba24,34,35, seguida de la corteza entorrinal medial (ENTm), el núcleo de la banda diagonal (NDB) y la corteza entorrinal lateral (ENTl). Cabe señalar que este patrón de entrada es diferente de los resultados de seguimiento retrógrado anteriores en células granulares dentadas, que reciben proyecciones considerablemente más débiles de ENTm que ENTl y entrada prominente de núcleos mamilares36,37, así como interneuronas SST en CA1, que reciben muy poca entrada de la corteza entorrinal38. Después de TBI, hubo un cambio en la distancia euclidiana de las neuronas marcadas con rabia al centroide de la célula iniciadora (Fig. 2d; Fig. 5 complementaria), lo que sugiere que las neuronas de entrada estaban sustancialmente más cerca de las células iniciadoras después de la lesión cerebral.

Se confirmó una mayor proporción de conexiones locales cuando analizamos la entrada a las interneuronas SST con mayor detalle. En los animales de control, aproximadamente el 40 % de las neuronas de entrada se detectaron fuera del hipocampo y el 8 % de las neuronas de entrada se ubicaron en el hemisferio contralateral. Las proporciones de estas entradas de largo alcance se redujeron significativamente en animales con TBI (Fig. 2e, f). Además, analizamos la probabilidad de entrada de neuronas en contenedores de 200 μm a lo largo de todo el eje anteroposterior (AP), desde 0 mm (bulbo olfatorio) hasta 13 mm (cerebelo) (Fig. 2g). Esto reveló aumentos significativos en el porcentaje de neuronas de entrada entre 6,8 mm y 7,4 mm a nivel del hipocampo (6,8–7 mm, ileso: 6,79 ± 0,79 %, TBI: 18,12 ± 5,03 %, P = 1,42E-11; 7– 7,2 mm, ileso: 7,15 ± 0,83 %, TBI: 18,31 ± 4,01 %, P = 3,02E-11, 7,2–7,4 mm, ileso: 8,67 ± 1,70 %, TBI: 16,72 ± 4,55 %, P = 7,64E-06; ANOVA bidireccional de medidas repetidas con la prueba post-hoc de Bonferroni; Datos complementarios 3) y disminuye de 10 mm a 10,2 mm al nivel de ENTm (control: 7,48 ± 2,04 %, TBI: 1,90 ± 1,03 %, P = 1,33E -02; ANOVA bidireccional de medidas repetidas con prueba post-hoc de Bonferroni; Datos complementarios 3). Después de TBI, se detectó un etiquetado de entrada masivo dentro del hipocampo ipsilateral, con una proporción significativamente mayor de entrada del área CA1 (Fig. 2h; Datos complementarios 4). Sin embargo, se encontró que las áreas distantes del cerebro que proporcionan la mayor proporción de entrada a las interneuronas SST en los controles, como ENTm y NDB, tenían una reducción significativa en la entrada después de TBI (Fig. 2h; Datos complementarios 4). Para comparar directamente los cambios en el número de neuronas de entrada en lugar de la proporción de entrada, calculamos el índice de convergencia para cada animal, definido como el número de neuronas de entrada etiquetadas con mCherry dividido por el número de GFP y células de arranque etiquetadas con mCherry. Este análisis también reveló un aumento significativo en la entrada de CA1 y disminuciones en la entrada de largo alcance de ENTm y NDB (Figura complementaria 7; Datos complementarios 5). Por lo tanto, hay un cambio dramático tanto en el número como en la proporción relativa de entradas locales y de larga distancia a las interneuronas SST del hipocampo después de una TBI.

La pérdida de información de largo alcance después de una TBI podría resultar de una pérdida de neuronas en sitios distantes o una pérdida de conexiones anatómicas. Para probar esto, y para caracterizar las identidades neuroquímicas de la entrada a las interneuronas SST hiliares, desarrollamos un método para rehidratar los mismos cerebros utilizados para la obtención de imágenes de láminas de luz y procesarlos para la inmunotinción de inmunofluorescencia doble tradicional (Fig. 3a-c). Debido a que la entrada de largo alcance a las interneuronas hiliares SST llega principalmente desde el prosencéfalo basal y ENTm, cuantificamos las poblaciones de neuronas en estas áreas.

un esquema que muestra el protocolo experimental para la limpieza cerebral inversa y el inmunomarcaje. b Dos neuronas de entrada marcadas con rabia (rojas) identificadas en una sección óptica sagital de NDB en un cerebro de control intacto. Animal representativo de n = 3 controles ilesos. Proyección de intensidad máxima de 50 μm obtenida mediante imágenes de lámina de luz de todo el cerebro. c Sección sagital que contiene las mismas neuronas de entrada (magenta) etiquetadas para CHAT (verde) después del procesamiento para inmunotinción tradicional e imágenes confocales. Animal representativo de n = 3 controles ilesos. La flecha indica una celda etiquetada conjuntamente. d NDB de control ileso (izquierda) y animal con lesión cerebral (derecha) etiquetado para CHAT (verde). Animales representativos de n = 3 ratones ilesos y 4 TBI. e Proporción de neuronas de entrada marcadas con rabia mCherry+ que expresaron CHAT. f Cuantificación de la densidad de neuronas CHAT+ en NDB ipsilateral y contralateral en controles ilesos y animales con lesiones cerebrales. n = 3 animales ilesos y 5 TBI. g Sección sagital de la circunvolución dentada en control ileso (izquierda) y animal con lesión cerebral (derecha) etiquetado para CHAT (verde) y DAPI (azul). Animales representativos de n = 3 ratones ilesos y 4 TBI. h, hilio; gcl, capa de células granulares; ml, capa molecular. H. Cuantificación de la densidad de axones CHAT+ en la circunvolución dentada ipsilateral y contralateral en controles ilesos y animales con lesiones cerebrales. n = 3 animales ilesos y 4 TBI. i ENTm de control ileso (izquierda) y animal con lesión cerebral (derecha) etiquetados para reelin (verde) y mCherry (magenta). Animales representativos de n = 3 animales ilesos y 5 TBI. j Proporción de neuronas de entrada marcadas con rabia mCherry+ que expresaron reelina. k Cuantificación de la densidad celular reelina+ en ENTm ipsilateral y contralateral. n = 3 animales ilesos y 5 TBI. Barras de error, sem; barras de escala, 100 μm. Consulte también la figura complementaria 8 y los datos complementarios 1. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El prosencéfalo basal contiene múltiples tipos de células que proyectan largas distancias a través de la vía fimbria/fórnix hacia el hipocampo, incluidas las neuronas colinérgicas, glutamatérgicas y GABAérgicas39. Tanto en los animales de control como en los animales lesionados, la mayoría absoluta de las neuronas de entrada de NDB a las interneuronas hiliares de SST expresaron colina acetiltransferasa (CHAT) (control: 67,1 ± 6,8 %, n = 3 ratones; TBI: 79,2 ± 12,5 %, n = 4 ratones; P = 0,99, prueba exacta de Fisher, Fig. 3d, e). Esto es diferente de las interneuronas inhibitorias en CA1, que reciben principalmente información GABAérgica del prosencéfalo basal38. No encontramos una diferencia en la densidad de las neuronas CHAT+ en NDB entre los animales de control y los animales con lesiones cerebrales (Fig. 3f), lo que sugiere que las neuronas CHAT+ no se redujeron en el prosencéfalo basal después de una TBI focal.

Debido a que las neuronas en NDB y ENTm se proyectan directamente en el hipocampo, es casi seguro que sus axones se dañan por TBI. Por lo tanto, a continuación examinamos si la TBI afectaba la densidad de las proyecciones colinérgicas en el hipocampo. Tanto en los animales de control como en los animales lesionados, había un plexo denso de procesos axonales CHAT+ que inervaban cada capa del hipocampo, incluso en el epicentro de la lesión (Fig. 3g, h). No detectamos una diferencia en la expresión de CHAT entre los grupos (control, ipsilateral: 20,8 ± 1,9 %, control, contralateral: 20,8 ± 1,7 %, n = 3 ratones; TBI, ipsilateral: 22,9 ± 0,6 %, TBI, contralateral: 22,0 ± 1,2%, n = 4 ratones, P = 0,96, ANOVA de dos vías). Estos resultados demuestran que la reducción de las neuronas de entrada de CHAT+ no estuvo acompañada de una pérdida general de aferentes de CHAT+ en el hipocampo después de una TBI.

Este resultado fue inesperado, porque se ha informado una pérdida de neuronas inmunorreactivas CHAT en el prosencéfalo basal de modelos de lesión difusa40,41. Para descartar la posibilidad de que las cuantificaciones celulares estuvieran influenciadas por el mapeo del circuito de la rabia o los procedimientos de limpieza del cerebro, examinamos una segunda cohorte independiente de animales de control y con lesiones cerebrales que no se sometieron a estos procedimientos (n = 6 controles, n = 4 animales TBI) . En este experimento de replicación, también encontramos números similares de neuronas CHAT+ en NDB de ratones de control y TBI de la misma edad (Fig. 8 complementaria).

Tanto en los animales de control como en los animales con lesiones cerebrales, las neuronas de entrada en ENTm se encontraron casi exclusivamente en la capa II (Fig. 3i). Aproximadamente el 90 % de estas células coexpresaron reelina y tenían morfologías de células estrelladas multipolares grandes (control: 86,8 ± 0,34 %, n = 3 ratones; TBI: 95,2 ± 4,8 %, n = 3 ratones; P = 0,99, prueba exacta de Fisher; Figura 3j). Estos resultados son consistentes con estudios previos que muestran que las células estrelladas que expresan reelina en ENTm dan lugar a la principal vía glutamatérgica asociativa conocida como vía perforante que se proyecta a la circunvolución dentada, las regiones CA3 y CA2 del hipocampo42,43,44. No encontramos una diferencia en la densidad de neuronas reelin+ en ENTm entre los animales de control y los animales con lesiones cerebrales (Fig. 3k), similar a nuestros resultados en el cerebro anterior basal. Juntos, nuestros resultados demuestran que hay una reducción en la cantidad de entrada a las interneuronas hiliares SST de las dos principales regiones distantes del cerebro que inervan la circunvolución dentada después de una TBI focal, pero estas áreas distantes permanecen estructuralmente intactas.

La entrada de CA1 aumentó más de 10 veces después de TBI. Para identificar qué tipos de neuronas CA1 proporcionan información a las interneuronas SST hiliares, evaluamos la posición laminar de las neuronas de entrada CA1 en el mismo tejido con aclaramiento inverso (Fig. 4). En los controles, ~65 % de las neuronas de entrada de CA1 se colocaron en la capa de células piramidales. Estas neuronas tenían características morfológicas de neuronas piramidales y expresaban WFS1, un marcador de neuronas piramidales CA1 (Fig. 4a). Una porción más pequeña de las neuronas de entrada de CA1 se encontró fuera de la capa piramidal y no expresó WFS1; estas son interneuronas putativas. En animales con lesiones cerebrales, hubo un aumento significativo en la proporción de neuronas de entrada ubicadas en la capa de células piramidales (control: 64,5 ± 14,0 %, n = 3 ratones; TBI: 92,1 ± 5,1 %, n = 4 ratones; P = 1,29 E-07, prueba Chi-cuadrado, Fig. 4b). Se podían ver claramente proyecciones robustas de estas neuronas entrando en la circunvolución dentada (Fig. 4a). Por lo tanto, hay un aumento en la entrada local de CA1 a las interneuronas hiliares SST después de TBI, y las neuronas piramidales de CA1 son la fuente principal de esta nueva entrada.

un CA1 en un control ileso (arriba) y un animal con lesión cerebral (abajo) etiquetado para rabia (azul) y WFS1 (rojo). Animales representativos de n = 3 ratones ilesos y 4 TBI. entonces, estrato oriens; sp, estrato piramidal; sr, estrato radiatum; ml, capa molecular; gcl, capa de células granulares. b Proporción de neuronas de entrada encontradas en cada capa de CA1. ***P = 1,29E-07, sin lesiones versus TBI, prueba de chi-cuadrado de dos caras. n = 45 células de 3 controles ilesos, 183 células de 4 ratones TBI. Barras de escala, 100 μm. Consulte también Datos complementarios 1. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Habiendo observado una reorganización dramática en todo el cerebro del circuito de interneuronas SST del hipocampo, luego preguntamos si la entrada a las neuronas SST también se reconectó lejos de la lesión. El PFC es un sitio límbico crítico de orden superior que es fundamental para la recuperación de la memoria y la toma de decisiones y recibe un patrón muy diverso de entradas que abarcan todo el cerebro, incluida la entrada directa del hipocampo45. A las 24 horas después de la lesión, la tinción con fluorojade C reveló neuronas en degeneración en el hipocampo y la neocorteza en el epicentro de la lesión, pero no se detectaron células marcadas en sitios distantes, como PFC, corteza entorrinal, prosencéfalo basal o tálamo (Fig. 9 complementaria). ). Este resultado es casi idéntico a los informes anteriores en este modelo46. Tampoco encontramos una diferencia en la densidad de neuronas SST + en PFC ocho semanas después de TBI (Figura complementaria 10; Datos complementarios 1). Estos resultados son consistentes con la producción de una lesión cerebral contusa altamente focal.

Para generar mapas de todo el cerebro de la entrada a las interneuronas SST en PFC, utilizamos el mismo enfoque basado en la rabia de dos virus para etiquetar las células iniciadoras de dos colores y las neuronas de entrada marcadas con mCherry en ratones SST-Cre (Fig. 5a, b ). Para estos estudios, PFC se definió como la inclusión de las siguientes subregiones en base a un consenso extraído de la literatura:45 área motora secundaria (MO), áreas cinguladas anteriores dorsal y ventral (ACAd y ACAv), área prelímbica (PL), área infralímbica ( ILA), corteza orbital medial, lateral y ventrolateral (ORBm, ORBl y ORBvl). Las inyecciones se hicieron en el hemisferio ipsilateral (es decir, el lado lesionado del cerebro). Encontramos que el 96,5% de las neuronas marcadas con GFP eran SST+, y no se etiquetaron neuronas en ninguna parte del cerebro después de inyectar el ayudante AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-eGFP-2A-oG y el virus RVΔG-mCherry en animales Cre- ( Figura complementaria 11). Tanto en los animales de control como en los animales con lesión cerebral, las células iniciadoras se ubicaron casi exclusivamente dentro del PFC (Fig. 5c-f). Las distribuciones regionales de las células iniciadoras fueron similares a lo que se publicó anteriormente para PFC47, y no se detectaron diferencias entre los grupos en la ubicación dorsal-ventral de las neuronas iniciadoras (Fig. 5d; Datos complementarios 6) o distribución de capas (Fig. 5e ), lo que indica que no hubo un sesgo importante en la ubicación de las celdas de arranque. Como era de esperar, hubo una correlación entre el número de neuronas de entrada y las neuronas de arranque, pero a diferencia del hipocampo, el número de neuronas de arranque no se redujo en los animales con lesión cerebral (control: n = 283,6 ± 69,5 células; TBI: n = 178,8 ± 18,2 células, P = 0,2, prueba t de dos colas, n = 5 animales por grupo, Fig. 5g).

a Izquierda: todo el cerebro limpiado con iDISCO+ y etiquetado para las neuronas que proporcionan información a las interneuronas PFC SST (blanco). Derecha: sección óptica sagital de 100 μm del mismo cerebro que muestra neuronas de entrada marcadas con rabia en el lugar de la inyección. b Región encuadrada que se muestra en (a) etiquetada para células iniciadoras (azul) y neuronas de entrada (roja). C. Secciones coronales esquemáticas (100 μm) que muestran células iniciadoras individuales registradas en un espacio de atlas estandarizado para controles no lesionados y animales con lesiones cerebrales. Cada color corresponde a un animal diferente. Un punto representa una neurona. n = 5 animales por grupo. d Gráficas de densidad de células kernel gaussianas de la distribución de neuronas de arranque en todo el cerebro a lo largo del eje dorsal-ventral. El sombreado gris representa la población agrupada con líneas individuales que representan a cada animal. e Distribución regional de células iniciadoras en controles no lesionados y animales con lesiones cerebrales. f Proporción de células iniciadoras identificadas dentro de PFC (PL, ACAd, ACAv, MO, ORBm, ORBvl, ILA). g Análisis de regresión lineal para el número de células iniciadoras y neuronas de entrada presinápticas (n = 5 ratones por grupo; R2 = 0,95). Barras de escala, 1 mm (a y c), 500 μm (b). Se proporciona una lista de abreviaturas en Datos complementarios 2. Consulte también las Figuras complementarias 9 a 12. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, cuantificamos la entrada a las interneuronas SST en PFC. El rastreo retrógrado de todo el cerebro reveló información de 178 regiones cerebrales distintas (Fig. 6a, Figs. complementarias 12, 13). La mayor parte de la entrada se detectó dentro de la isocorteza, especialmente en el hemisferio ipsolateral, seguido por el tálamo, el hipocampo y el pallidum. Estos resultados son comparables a los resultados anteriores de seguimiento retrógrado en animales de control47,48. Dentro de la isocorteza, las subregiones de PFC proporcionaron la información más destacada; el área insular agranular y el área del hipocampo CA1 también proporcionaron información destacada. El análisis de la probabilidad de entrada a lo largo del eje AP mostró aumentos significativos en el porcentaje de neuronas de entrada entre 3,2 y 3,4 mm al nivel de PFC en animales con lesión cerebral (no lesionados: 9,14 ± 1,14 %, TBI: 12,06 ± 1,41 %, P = 4.82E-03; ANOVA de medidas repetidas de dos vías con la prueba post hoc de Bonferroni; Datos complementarios 7). A lo largo del eje medial-lateral (ML), detectamos una proporción significativamente mayor de neuronas de entrada entre 0,2 y 0,5 mm lateral a la línea media en el hemisferio ipsilateral (5,9–6,0 mm, ileso: 8,37 ± 1,38 %, TBI: 11,38 ± 1,69 %, P = 9,09E-07, 6,0–6,1 mm, ileso: 10,20 ± 1,12 %, TBI: 13,35 ± 0,81 %, P = 2,08E-07, 6,1–6,2 mm, ileso: 8,94 ± 0,61 %, TBI: 11,90 ± 1,24 %, P = 1.68E-06; ANOVA bidireccional de medidas repetidas con la prueba post-hoc de Bonferroni; Datos complementarios 7), y se encontró una proporción significativamente menor de neuronas de entrada entre 0.4 y 0.5 mm lateral a la línea media en el hemisferio contralateral (5,2 a 5,3 mm, sin lesiones: 3,22 ± 0,34 %, TBI: 1,35 ± 0,32 %, P = 3,51E-02; ANOVA bidireccional de medidas repetidas con la prueba post-hoc de Bonferroni; Fig. 6b, Datos complementarios 7). Hubo una disminución significativa en el porcentaje general de entrada contralateral a las interneuronas SST después de TBI (Fig. 6c), similar a lo que observamos en el hipocampo. Sin embargo, no se detectaron diferencias en la distancia media de las neuronas de entrada al centroide de la célula iniciadora (Fig. 6d) o el porcentaje general de neuronas de entrada ubicadas fuera del PFC ipsilateral (Fig. 6e).

a Secciones coronales esquemáticas (100 μm) que muestran neuronas de entrada individuales registradas en el espacio de atlas estandarizado para controles ilesos (azul) y animales con lesiones cerebrales (rojo). Un punto representa una neurona. n = 5 animales por grupo. b Gráficas de densidad de células kernel gaussianas de la distribución de neuronas de entrada en todo el cerebro a lo largo del eje anterior-posterior (AP) y medial-lateral (ML). El sombreado gris representa la población agrupada con líneas individuales que representan a cada animal. Bregma, 5,3 mm; línea media, 5,7 mm. c Proporción de neuronas de entrada que se encuentran en el hemisferio contralateral. No lesionado: 14,00 ± 1,02%; TCE: 8,22 ± 0,98 %; n = 5 ratones por grupo; **P = 3.41E-03; prueba t de dos colas. d Cuantificación de la distancia euclidiana promedio entre el centroide de la célula iniciadora y las posiciones de las neuronas de entrada. n = 5 animales por grupo. e Proporción de neuronas de entrada que se encuentran fuera de la PFC ipsilateral. n = 5 animales por grupo. f Proporción del input total procedente de regiones cerebrales de alto nivel. ***P = 2,84E-06, ileso versus TBI (IsoCTX, contralateral), ***P = 4,46E-10, ileso versus TBI (IsoCTX, ipsilateral), ***P = 4,12E-05, ileso versus TBI (TH, ipsilateral); n = 5 ratones por grupo; ANOVA bidireccional de medidas repetidas con la prueba post hoc de Bonferroni. g Proporción de entrada presináptica total que surge de las áreas talámicas. ***P = 1,16E-11, ileso versus TBI (ATN, ipsilateral), *P = 4,46E-02, ileso versus TBI (VENT, ipsilateral); n = 5 ratones por grupo; ANOVA bidireccional de medidas repetidas con la prueba post hoc de Bonferroni. h Mapa de calor que muestra la proporción de neuronas de entrada identificadas en todas las regiones discretas del cerebro que inervan PFC. ***P = 1,00E-15, ileso versus TBI (ACAd, ipsilateral), ***P = 1,00E-15, ileso versus TBI (ILA, ipsilateral), ***P = 1,00E-15, ileso versus TBI (ORBm, ipsilateral), *P = 1,25E-02, ileso versus TBI (ORBvl, ipsilateral), ***P = 1,00E-15, ileso versus TBI (PL, ipsilateral), ***P = 1,18E -04, ileso frente a TBI (PL, contralateral), ***P = 1,07E-05, ileso frente a TBI (AM, ipsilateral); n = 5 ratones por grupo; ANOVA bidireccional de medidas repetidas con la prueba post-hoc de Bonferroni. Barras de error, sem; barra de escala, 1 mm. Se proporciona una lista de abreviaturas en Datos complementarios 2. Véanse también las Figs. complementarias. 12 a 14, Datos complementarios 7 a 9 y Películas complementarias 3 y 4. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Las neuronas de entrada se agruparon inicialmente según grandes divisiones funcionales, es decir, isocorteza, áreas olfativas, formación del hipocampo, subplaca cortical, cuerpo estriado, pallidum, tálamo, hipotálamo, mesencéfalo y rombencéfalo. En animales con lesiones cerebrales, encontramos que las interneuronas SST en PFC recibieron un porcentaje significativamente mayor de entrada total de la isocorteza ipsilateral en comparación con los controles, pero el porcentaje de neuronas de entrada en la isocorteza contralateral y el tálamo ipsilateral se redujeron (Fig. 6f; Suplementario Datos 8). En el tálamo, los núcleos talámicos anteriores (ATN) y el grupo ventral del tálamo dorsal (VENT) mostraron una proporción significativamente menor de neuronas de entrada después de TBI (Fig. 6g). El análisis de todo el cerebro de las neuronas de entrada en todas las áreas discretas del cerebro reveló que seis de las siete áreas con entrada alterada después de TBI estaban en la isocorteza (Fig. 6h). En particular, no todas las regiones de PFC en el hemisferio ipsilateral tenían una proporción significativamente mayor de neuronas de entrada; la entrada de ACAd y ORBvl se redujeron significativamente después de TBI. La proporción de entrada de PL contralateral también se redujo después de TBI. Se obtuvieron resultados similares al analizar el índice de convergencia para cada animal (Fig. 14 complementaria; Datos complementarios 9). Este patrón de conectividad local mejorada y entrada de largo alcance reducida es similar a lo que observamos en el hipocampo con lesión cerebral, lo que sugiere que incluso en regiones del cerebro muy alejadas del sitio de la lesión, la organización topográfica de las neuronas inhibidoras se reconfigura dramáticamente después de un cerebro focal. lesión.

Los injertos de progenitores de interneuronas derivados de embriones permiten una sólida restauración de la inhibición y son terapéuticos en una amplia gama de trastornos cerebrales adquiridos, incluida la epilepsia49, la enfermedad de Alzheimer50 y la TBI51. Sin embargo, se desconoce la base del circuito para esta regeneración. Por lo tanto, probamos si los progenitores de interneuronas son capaces de establecer conexiones locales y de largo alcance apropiadas en un cerebro dañado. Para este propósito, recolectamos progenitores GABA de la eminencia ganglionar medial (MGE), el origen del desarrollo de casi todas las interneuronas corticales que expresan SST6. Luego, 7 días después de TBI, trasplantamos 3 × 104 células MGE en el hipocampo ipsolateral de ratones C57BL/6 J en el epicentro de la lesión. Esto corresponde al período de máxima desaferenciación después de TBI52. Primero examinamos injertos de interneuronas SST recolectadas de ratones donantes E13.5 SST-Cre cruzados con el reportero Ai6 para permitir su visualización después del trasplante. A los 35 días después del trasplante (DAT), se encontraron interneuronas trasplantadas en todos los subcampos del hipocampo (n = 3 animales) (Fig. 7a, b, Fig. 15 complementaria). La mayoría de las células marcadas con Ai6 expresaron SST (83 ± 2,1 %, Fig. 7c), lo que confirma la expresión selectiva de Cre en la población de SST de células MGE trasplantadas.

a Izquierda: sección coronal del hipocampo dorsal cinco semanas después del trasplante etiquetada para interneuronas trasplantadas que expresan Ai6 (amarillo) y DAPI (azul). Animal representativo de n = 3 ratones. Barra de escala, 1 mm. Derecha: neuronas que expresan Ai6 (amarillo) comarcadas para somatostatina (magenta). Barra de escala, 100 μm. b Distribución de interneuronas SST trasplantadas 35 DAT, n = 3 ratones. c Proporción de células que expresan Ai6 que expresaron somatostatina, n = 3 ratones. Barras de error, sem Consulte también la figura complementaria 15. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, realizamos un mapeo de todo el cerebro para identificar entradas locales y de largo alcance a las interneuronas SST trasplantadas en el cerebro lesionado. Para estos experimentos, se obtuvieron células donantes de embriones SST-Cre+ que no contenían el indicador Ai6. Los trasplantes se realizaron 7 días después de la TBI, las inyecciones de virus se realizaron en el hipocampo a las 8 semanas (AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-eGFP-2A-oG) y 11 semanas (RVΔG-mCherry) después de la lesión, y los animales fueron procesados. para la limpieza y el análisis del cerebro 7 días después de la inyección final del virus. Este período corresponde a un momento en que el trasplante de MGE muestra efectos terapéuticos sólidos sobre la memoria y las convulsiones en animales con lesiones cerebrales51. Encontramos cantidades sustanciales de neuronas de entrada en todo el cerebro marcadas por el virus de la rabia (Fig. 8a-c). En particular, las neuronas de entrada se identificaron en 14 áreas cerebrales distintas, incluidas todas las regiones del hipocampo, ENTm, ENTl, tabique medial y NDB (Fig. 8c-f, Fig. 16 complementaria). La mayor parte de la entrada provino del hipocampo, incluida una entrada robusta del área CA3 y CA1. Este patrón de entrada local fue similar a lo que observamos en animales con lesiones cerebrales que no recibieron trasplantes en lugar de controles (Figura complementaria 17). Para determinar si las entradas regionales covarían, calculamos los coeficientes de correlación de Pearson para cada par de regiones de entrada. Esto mostró una correlación positiva significativa entre varias regiones de entrada, incluidas CA1, CA2, núcleo magnocelular (MA), prosubiculum (ProS), subiculum (SUB) y corteza perirrinal (PERI), lo que indica que cuando las neuronas trasplantadas reciben información de una región, generalmente recibió información de las otras regiones correlacionadas (Fig. 8g). Por lo tanto, las interneuronas SST trasplantadas recibieron patrones de entrada ortotópicos, pero las células trasplantadas mostraron una entrada local mejorada observada después de TBI.

a Una sección óptica sagital de 100 μm de la circunvolución dentada etiquetada para células trasplantadas (azul) y neuronas de entrada (naranja). Flechas blancas, celdas de arranque. h, hilio; gcl, capa de células granulares; ml, capa molecular. b Izquierda: representación de cerebro completo del hemisferio ipsilateral completo del mismo animal que se muestra en (a) etiquetado para neuronas de entrada (blanco). El círculo punteado delinea el borde de la lesión que recubre el hipocampo (HIP). Derecha: Representación de todo el cerebro que muestra las neuronas de entrada en el núcleo central superior del rafae (CS), el tabique medial (MS) y el núcleo de la banda diagonal (NDB). Animal representativo de n = 5 ratones. c Secciones coronales esquemáticas (250 μm) que muestran células iniciadoras individuales (rojas) y neuronas de entrada (azules) registradas en el espacio de atlas estandarizado. Un punto representa una neurona. n = 5 animales. d Proyecciones de intensidad máxima (100 μm) de neuronas que proporcionan información a las interneuronas SST trasplantadas en el cerebro lesionado intacto. Animales representativos de n = 5 ratones. e Arriba: proporción de células iniciadoras trasplantadas que se encuentran en cada capa del hipocampo. Abajo: gráfico de burbujas de áreas del cerebro que contienen neuronas de entrada marcadas con rabia. f Gráfica de densidad de células kernel gaussiana de la distribución de neuronas de entrada en todo el cerebro a lo largo del eje anterior-posterior. El sombreado gris representa la población agrupada con líneas individuales que representan a cada animal. g Matriz de correlación de entrada a interneuronas SST trasplantadas. Tamaño y color, coeficiente de correlación. *P < 0,05, los valores P exactos se proporcionan en el archivo de datos de origen; correlación de Pearson bilateral. Barras de escala, 100 μm (a, g), 1 mm (b, c). Se proporciona una lista de abreviaturas en Datos complementarios 2. Consulte también las Figuras complementarias 16 y 17, Datos de origen y Película complementaria 5. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Usando un modelo de ratón de TBI focal, informamos una evaluación sistemática de la reorganización de circuitos a gran escala en un cerebro dañado. Asignamos la entrada de todo el cerebro a un solo tipo de célula con alta relevancia terapéutica, las interneuronas SST, en controles ilesos, después de una lesión cerebral y después del trasplante en animales con lesión cerebral. Nuestros datos demuestran que las interneuronas SST supervivientes obtienen una nueva entrada local después de la TBI, pero en gran medida están desconectadas de regiones cerebrales distantes. Esto ocurrió en dos áreas cerebrales espacialmente distintas pero que interactúan: el sitio de la lesión en el hipocampo y lejos de la lesión en PFC, que no fue dañado directamente por TBI. Nuestra observación de la reorganización del circuito lejos de la lesión fue inesperada, porque la LCT no dañó directamente la PFC y los resultados de los experimentos de tinción con plata sugieren que las proyecciones interhemisféricas no se degeneran46. Por lo tanto, el recableado del circuito postraumático no se limita solo a las áreas dañadas, sino que ocurre ampliamente en todo el cerebro en respuesta a una lesión focal. Mostramos además que las conexiones de largo alcance disminuidas no fueron el resultado de la pérdida de células en áreas cerebrales distantes o una reducción general en las colaterales del axón que se proyectan en el hipocampo dañado. Las interneuronas SST trasplantadas se integraron sólidamente en el hipocampo con lesión cerebral y recibieron información del huésped local y de largo alcance que se asemejaba a las conexiones de las interneuronas nativas. Esto es consistente con estudios funcionales ex vivo previos que documentan un fuerte impulso excitatorio en interneuronas trasplantadas del cerebro huésped49,51,52, aunque la fuente de estas entradas se desconocía anteriormente.

La LCT produce importantes alteraciones estructurales y funcionales en los circuitos neurales, como resultado de un daño cerebral progresivo y respuestas secundarias de neuroplasticidad, que se desarrollan con el tiempo53,54. Hasta hace poco, nuestra comprensión de cómo TBI daña el diagrama de cableado del cerebro se ha limitado a enfoques estándar de neuroanatomía y electrofisiología de corte. Estos estudios muestran que las neuronas principales experimentan una desaferenciación inicial después de una LCT, posiblemente debido a la pérdida de neuronas de entrada53,54,55,56. A esto le sigue un aumento progresivo en el número de contactos sinápticos y la formación de nuevos circuitos excitatorios dentro de las áreas lesionadas del cerebro54,57,58,59,60,61,62. El impulso excitatorio sobre las interneuronas SST del hipocampo, que normalmente reciben escasa información de las neuronas principales locales, también aumenta después de una lesión cerebral24. Sin embargo, las grabaciones de corte se limitan a resolver las conexiones funcionales de unas pocas neuronas dentro de los circuitos locales, porque están quirúrgicamente aisladas de la entrada aferente de largo alcance. Al mapear de manera integral las entradas de todo el cerebro a las interneuronas SST a resolución celular, encontramos una mejora significativa de las neuronas de entrada locales a las interneuronas hiliares SST después de TBI, de acuerdo con estudios de electrofisiología de cortes anteriores. Además, identificamos fuentes de entrada previamente desconocidas en los controles, como una vía de retroproyección desde CA1 a las interneuronas hiliares SST que se mejora después de TBI. En particular, las interneuronas CA1 también son capaces de proyectarse a la circunvolución dentada en modelos de epilepsia del lóbulo temporal25, pero estas células inervan principalmente células granulares.

Estudios previos de conectividad funcional asumen que TBI aleja al cerebro de una arquitectura de mundo pequeño, definida como redes locales densamente conectadas unidas por una entrada escasa de largo alcance que conecta áreas discretas del cerebro63. De acuerdo con este concepto, la conectividad de IRMf interhemisférica en estado de reposo se reduce después de TBI64, posiblemente como resultado de una lesión axonal difusa63, y hay un aumento temporal en la hiperconectividad de las redes locales que generalmente se debilita con el tiempo65. Si bien estos métodos son útiles para las hipótesis generales sobre la conectividad cerebral, no pueden identificar una base estructural precisa para la disfunción del circuito en TBI y probablemente estén influenciados de manera desproporcionada por las neuronas excitatorias. Nuestros datos de mapeo de circuitos no son del todo consistentes con esta idea a nivel de tipo de celda. Tanto en el hipocampo como en la PFC, encontramos que las fuentes más prominentes de entrada de largo alcance a las interneuronas SST, incluida la entrada del hemisferio contralateral, disminuyeron después de la LCT focal, pero las conexiones locales aumentan de forma crónica. Por lo tanto, TBI puede mejorar permanentemente el mundo pequeño de los circuitos inhibitorios al aumentar las conexiones de la red local y hacer que la entrada de largo alcance sea más escasa. Hay apoyo para esta idea en los estudios de conectividad funcional humana66.

Hay un daño axónico obvio después de CCI46, y esto probablemente afecta la entrada de largo alcance al hipocampo. No podemos excluir la posibilidad de que parte de la reorganización estructural que observamos después de la TBI esté influenciada por el daño a los tractos de materia blanca. Sin embargo, el daño del axón por sí solo no puede explicar completamente los cambios de circuito de largo alcance que observamos en animales con lesiones cerebrales. En el hipocampo, encontramos una reducción de ~4 veces en la entrada de largo alcance a las interneuronas SST que no estuvo acompañada de pérdida de células en regiones cerebrales distantes o sus proyecciones en el hipocampo (p. ej., CHAT+aferentes). Esto sugiere que las regiones de entrada no están desconectadas de las interneuronas SST por una pérdida general de neuronas de entrada o axotomía. Más bien, las entradas se pueden agregar o eliminar de una manera específica del tipo de celda. Es posible que los aferentes de largo alcance sean dañados selectivamente por la CCI, pero que por lo demás permanezcan intactos. Por ejemplo, es bien sabido que la TBI interrumpe los mecanismos de transporte axonal67, y esto podría afectar de manera desproporcionada el transporte retrógrado de la rabia a las neuronas de entrada presinápticas de largo alcance. Sin embargo, nuestro hallazgo de que las interneuronas trasplantadas son capaces de establecer conexiones de larga distancia sugiere que el potencial para volver a crecer estas entradas disminuidas se mantuvo en todos los animales con lesiones cerebrales. Encontramos aumentos similares en la entrada local y disminuciones en la entrada de largo alcance a las interneuronas SST en PFC. A diferencia del hipocampo, estas proyecciones no se dañan directamente y no degeneran después de CCI46. De particular interés es el tálamo anteromedial, que fue la única área talámica con neuronas de entrada alteradas después de TBI. El tálamo anterior (ATN, compuesto por subdivisiones anteromedial, anteroventral y anterodorsal) proporciona un circuito subcortical que respalda la memoria y la navegación espacial68, comportamientos que se ven profundamente afectados en modelos de TBI en roedores. Es posible que la actividad excesiva en el hipocampo dañado pueda conducir a cambios posteriores en la PFC (p. ej., a través del circuito hipocampo-ATN-PFC). Alternativamente, las convulsiones están bien documentadas en este modelo de lesión y podrían conducir a la reorganización del circuito en todo el cerebro. Sin embargo, nuestros resultados sugieren que la TBI focal conduce a una reasignación generalizada de entradas a las interneuronas SST en todo el cerebro, independientemente de si hubo lesión directa o pérdida de células.

Con muchas menos neuronas inhibitorias en el hipocampo dañado, la LCT impone exigencias extraordinarias a las interneuronas supervivientes. Hay tres características fisiológicas de las interneuronas SST que podrían explicar por qué una pérdida de entrada de largo alcance podría reflejar una respuesta compensatoria al daño. En primer lugar, las interneuronas SST reciben entradas sinápticas excitatorias fuertemente facilitadoras y tienen otras propiedades de membrana que permiten que estas células se activen mediante un estallido de alta frecuencia de una sola neurona presináptica69,70. En el hipocampo, obtener información de las neuronas principales locales y perder la información de ENTm puede ayudar a estabilizar la actividad de la red local después de TBI71. En segundo lugar, la despolarización mediada por muscarínicos puede producir picos prolongados en las interneuronas SST72. Dadas las ricas inervaciones locales después de una TBI, la pérdida de entrada de CHAT del prosencéfalo basal podría reflejar una estrategia para equilibrar el impulso excitatorio de este importante tipo de célula en el cerebro lesionado. En tercer lugar, incluso una sola interneurona dirigida a las dendritas puede controlar la generación de picos en las neuronas corticales principales7. Por lo tanto, un cambio de la inhibición de la retroalimentación a las dendritas, a través de la pérdida de entrada de largo alcance y retroproyecciones locales mejoradas, puede reflejar una estrategia potencial para integrar la entrada de entrada y mantener la escasa activación de las células granulares dentadas que permite la memoria. y previene las convulsiones73,74. Alternativamente, el aumento de la entrada local puede sincronizar las interneuronas SST, respaldar patrones de actividad patológica o impedir la coordinación entre áreas discretas del cerebro. Se requerirá más trabajo que combine la neurofisiología in vivo con la manipulación selectiva de los tipos de células del hipocampo para aclarar estas posibilidades.

La capacidad de las interneuronas SST trasplantadas para incorporarse estructuralmente en el hipocampo dañado fue sorprendente dada la dramática reorganización de los circuitos inhibidores en el cerebro lesionado. Aunque la conectividad de las células huésped-donante se ha documentado ampliamente75,76, no se ha documentado la entrada anatómica precisa de los tipos de neuronas individuales. La especificidad del tipo de célula es una consideración importante, especialmente para comprender la base del circuito de la enfermedad. A pesar de la plasticidad reactiva masiva en el cerebro dañado, descubrimos que las interneuronas trasplantadas reciben información altamente ortotópica que es específica del tipo de célula en lugar de específica de la región. Proponemos que los efectos beneficiosos del trasplante de interneuronas observados en varios modelos de enfermedades preclínicas están impulsados ​​por la integración precisa de los precursores de interneuronas en los circuitos cerebrales del huésped. Este punto de vista está respaldado por una gran cantidad de evidencia que informa que la estructura general y la función de las interneuronas trasplantadas se parecen mucho a sus contrapartes nativas49,51,52,77,78,79, así como la inactivación reciente de DREADD y la pérdida de función de VGAT estudios que demuestran que los efectos terapéuticos están ligados a la integración electrofisiológica de las interneuronas trasplantadas51,80. Un punto de vista alternativo sugiere que los precursores de las interneuronas forman solo contactos débiles con el cerebro del huésped81 y funcionan indirectamente mediante la liberación de factores de rejuvenecimiento que modifican los circuitos del cerebro del huésped82. Sin embargo, los estudios electrofisiológicos detallados informan consistentemente fuertes conexiones sinápticas51,52,83,84 y queda por identificar evidencia directa de un circuito rejuvenecedor. En el estudio actual, no pudimos probar directamente las conexiones sinápticas entre las interneuronas trasplantadas, porque no fue posible distinguir las células iniciadoras de las neuronas SST marcadas con AAV que recibieron la rabia a través del transporte retrógrado. Sin embargo, la gran mayoría de las neuronas de entrada locales eran neuronas principales putativas, no neuronas inhibitorias (según la morfología y la ubicación laminar). Esto es consistente con una literatura sólida sobre el trasplante de MGE que utiliza análisis ultraestructural EM, neuroanatomía y electrofisiología de pinza de parche que demuestra que la mayoría de las conexiones sinápticas son con las células principales del cerebro huésped51,52,77,81,82,83,84,85.

El patrón de recableado del circuito sináptico después de una TBI es complejo. Nuestros resultados sugieren que el daño cerebral focal reorganiza los circuitos inhibitorios a escala global. Esperamos que este enfoque experimental sirva como un marco útil para considerar los análisis de todo el cerebro de la disfunción de la red en TBI y trastornos cerebrales relacionados.

Todos los procedimientos con animales se realizaron bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) por parte de la Universidad de Recursos de Animales de Laboratorio en la Universidad de California, Irvine y se adhirieron a las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los experimentos se realizaron en ratones adultos de ambos sexos mantenidos en condiciones de alojamiento estándar en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con comida y agua ad libitum. Para las cuantificaciones de células SST, usamos ratones GIN mantenidos en un fondo FVB (Jax Stock No: 003718). Para el rastreo del circuito de la rabia, usamos ratones Sst-IRES-Cre mantenidos en un fondo C57BL/6 J (Jax Stock No: 018973). Utilizamos ratones C57BL/6 J (Jax Stock No: 000664) para experimentos de fluoro-jade C. Para los trasplantes de células, se produjo tejido de donante embrionario cruzando ratones Sst-IRES-Cre J con ratones C57BL/6 J (Jax Stock No: 000664) o ratones informadores Ai6-ZsGreen (Jax Stock No: 007906); los ratones anfitriones eran ratones C57BL/6 J (Jax Stock No: 000664).

Los experimentos se realizaron en compañeros de camada machos y hembras entre P55 y P139. Tras el destete, los animales se codificaron y asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento sin lesiones (control sin tratamiento previo), TBI o inyectados con MGE. Los ratones con lesiones cerebrales y los controles de la misma edad se alojaron juntos (2 a 5 animales por jaula) dentro de un ciclo de temperatura (21 a 22 °C), humedad (40 a 51 %) y luz (ciclo de 12 h de luz:oscuridad). ) vivero controlado. También se aleatorizó el orden de lesión, inyección de virus y trasplante de células. No fue posible el cegamiento debido a la presencia de una lesión en el grupo de tratamiento de LCT. Los experimentos de inmunotinción de CHAT se replicaron utilizando una cohorte separada e independiente de animales de control y con lesiones cerebrales. No se realizaron otros estudios de replicación.

La lesión por CCI se realizó en ratones machos y hembras adultos en P5518. Brevemente, los ratones fueron anestesiados por inhalación de isoflurano al 2% y colocados en un marco estereotáxico personalizado. Se expuso el cráneo mediante una incisión en la línea media y se realizó una craneotomía de 4-5 mm ~1 mm lateral a la sutura sagital y centrada entre bregma y lambda. Se quitó la tapa del cráneo sin dañar la duramadre subyacente. El dispositivo de contusión consistía en un impactador accionado neumáticamente, controlado por computadora, equipado con una punta biselada de acero inoxidable de 3 mm de diámetro (Precision Systems and Instrumentation; TBI-0310). La lesión cerebral se produjo utilizando este dispositivo para comprimir la corteza a una profundidad de 1,0 mm a una velocidad de 3,5 m s−1 y 500 ms de duración. La incisión se suturó sin reemplazar la tapa del cráneo y se permitió que el animal se recuperara sobre una almohadilla térmica. Se realizó una evaluación cualitativa de la salud postoperatoria diariamente durante 7 días después de la LCT y periódicamente a partir de entonces. Todos los animales que recibieron cirugía fueron tratados con clorhidrato de buprenorfina (Buprenex; 0,05 mg/kg, administrado ip) en el momento de la cirugía y 24 h después. Todos los ratones con lesión cerebral sobrevivieron y permanecieron sanos hasta el día de la experimentación.

AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-GFP-2A-oG con un título de 1,2 × 1013 copias del genoma/mL se obtuvo de GT3 Core Facility del Instituto Salk y se diluyó a un título de 2,4 × 1011 copias del genoma/mL en NaCl al 0,9 % estéril antes de su uso, para evitar alteraciones en el rendimiento del trazado86. RVΔG-mCherry se produjo como se describió anteriormente87 con un título de 5 × 109 unidades infecciosas/mL. El virus se cargó frontalmente en micropipetas de vidrio biselado (40 μm de diámetro de punta, Wiretol 5 μl, Drummond Scientific) y se inyectó en los cerebros de ratones adultos ilesos de control y ratones con lesiones cerebrales a una velocidad de 15 nL min–1 y la aguja se dejó en su lugar. durante 5 min antes de la retracción. Las coordenadas de los objetivos se verificaron primero en una serie de estudios de inyección preliminares en ratones de control y con lesiones cerebrales para determinar las ubicaciones ideales de los objetivos (p. ej., el hilio) y el título y el volumen del virus que podría administrarse en el hilio o PFC sin fugas en las regiones cercanas. Se realizaron inyecciones de AAV (200 nL) en el hilio de la circunvolución dentada en las siguientes coordenadas estereotáxicas: anterior-posterior (AP) -2,0 mm, medial-lateral (ML) 1,30 mm, dorsal-ventral (DV) -1,9 mm. En una cohorte separada de animales, se realizaron inyecciones en la corteza prelímbica: AP 1,8 mm, ML 0,35 mm y DV −1,4 mm. RVΔG-mCherry (100 nL) se inyectó 3 semanas más tarde en el mismo lugar.

Los ratones se perfundieron transcardiacamente con PBS 0,1 M que contenía 1 ul/ml de heparina sódica 10 mg/ml (Nº de catálogo Serva 24590.01) seguido de PFA al 4 % en PBS 0,1 M. Las muestras se posfijaron durante la noche en PFA al 4 % en PBS 0,1 M. Los pasos subsiguientes se realizaron en tubos de centrífuga de 5 ml (Eppendorf cat. No 0030119401) con 0,01 % de azida sódica añadida a cada solución. En primer lugar, las muestras se decoloraron en 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato al 10 % (CHAPS, Anatrace cat. no. C316S) y al 25 % de N-metil dietanolamina (MDEA, Alfa-Aesar cat. no. L15712). ) en PBS 0,1 M durante 48 h a 37 °C con nutación. A continuación, las muestras se lavaron en PBS 0,1 M durante 24 h, se deshidrataron en un gradiente de metanol/agua (20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 %, 100 %) durante 1 h cada una y se eliminaron los lípidos en DCM 2:1: MeOH durante la noche. Al día siguiente, las muestras se lavaron dos veces en MeOH al 100 % durante 4 h para eliminar DCM:MeOH y se blanquearon en H2O2 al 5 % en MeOH al 80 % durante la noche a 4 °C sin agitación. A continuación, las muestras se rehidrataron en MeOH al 60 %, MeOH al 40 %, MeOH al 20 %, PBS 0,1 M y PTx.2 durante 1 h, se incubaron en clorhidrato de guanidina 4 M (Alfa-Aesar, n.° de cat. A13543-30) y CHAPS al 1 %. en PBS 0,1 M durante 24 h y se lavó durante la noche en PBS 0,1 M con tres cambios de solución. A continuación, las muestras se permeabilizaron en CHAPS al 10 %/MDEA al 25 % en PBS 0,1 M durante la noche a 37 °C con nutación, se incubaron en NDS al 3 %/DMSO al 10 % en PTx.2 con nutación a 37 °C durante la noche. Las incubaciones de anticuerpos primarios se realizaron en PBS 0,1 M heparinizado que contenía Tween-20 al 0,2 % (PTwH) que contenía CHAPS al 0,25 %, NDS al 3 % y anticuerpos anti-DsRed de conejo (1:1000) y anti-GFP de pollo (1:1000) durante 7 días a 37 °C con nutación. Luego, las muestras se lavaron en PTwH durante la noche en un agitador orbital (115 RPM) a temperatura ambiente con cinco cambios de solución. El diluyente del anticuerpo secundario se preparó en PTwH que contenía CHAPS al 0,25 %, burro anticonejo 546 (1:1000) y cabra antipollo 647 (1:1000), filtrado en jeringa a 0,2 μm e incubado durante 7 días a 37 °C con nutación antes del lavado en PTwH durante la noche con cinco cambios de solución y agitación a temperatura ambiente. Al día siguiente, las muestras se deshidrataron en gradientes crecientes de metanol/agua (20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 % durante 1 h cada una) y se dejaron reposar en MeOH al 100 % durante la noche a 4 °C. A continuación, las muestras se lavaron en DCM/MeOH 2:1 durante 3 h, seguido de dos lavados con DCM al 100 % durante 15 min cada uno y se aclararon en éter dibencílico (DBE) durante la noche a 4 °C. El DBE se cambió cuatro veces más antes de obtener la imagen para la comparación del índice de refracción. Puede encontrar un protocolo paso a paso para la inmunotinción de todo el cerebro en: https://github.com/roberthuntlab/clearedbrainanalysis.

Las muestras limpias se montaron en un portamuestras impreso en 3D en una cámara de imágenes personalizada con el mismo lote de solución DBE que se usó para la comparación del índice de refracción y se tomaron imágenes con un microscopio de lámina de luz Zeiss Z1 con el software Zeiss Zen. Se tomaron imágenes de las muestras en orientación sagital con iluminación de un solo lado utilizando un objetivo de iluminación x5/0,1 y un objetivo de detección x5/0,16 a una resolución de 0,91 μm/píxel con un tamaño de paso de 4,97 μm. Se tomaron imágenes de las neuronas de entrada marcadas con mCherry utilizando un láser de 561 nm acoplado a un filtro BP de 575–625 nm. Los canales GFP y de autofluorescencia se adquirieron simultáneamente con líneas láser de 488 nm y 638 nm acopladas a filtros BP de 505–545 nm y LP de 660 nm. La potencia del láser se ajustó al 40 % de intensidad para todas las líneas de láser con una exposición de 200 ms. La superposición de mosaicos se estableció en 8%.

Los datos sin procesar (.czi) se convirtieron a formato jerárquico (.ims) utilizando Imaris File Converter 9.1 (Bitplane). Los datos del canal de 561 nm se muestrearon por un factor de dos en cada dimensión y se exportaron como matrices numpy (.npy) utilizando secuencias de comandos de Python personalizadas. Las baldosas individuales se cosieron de forma no rígida utilizando WobblySitcher88. Las matrices cosidas se exportaron como series .tif con un valor de resta de fondo determinado para cada animal. Las posiciones de celdas individuales se anotaron manualmente usando cellfinder33. Las pilas de imágenes se muestrearon a una resolución de 10 μm y se registraron en Allen Reference Atlas89 usando brainreg, un puerto Python de aMAP90. Los límites del Atlas se muestrearon a la imagen original de alta resolución en la Imagen J, y los planos de la imagen que contenían celdas se inspeccionaron para verificar su precisión. Para corregir el error de registro de todo el cerebro, se marcaron manualmente pares de puntos de correspondencia donde los límites del atlas divergían de los puntos de referencia anatómicos. Se calculó la longitud promedio del vector y las posiciones de las celdas anotadas se transformaron linealmente en función de la longitud del vector del punto de correspondencia. Los esquemas de la posición anatómica de las células iniciadoras y las neuronas de entrada se trazaron utilizando brainrender32. Las placas de atlas coronales se renderizaron en posiciones seleccionadas a lo largo del eje anterior/posterior y las posiciones de las células individuales ± 125 μm (trazado de hipocampo) o ± 50 μm (trazado de PFC) con respecto a la placa de atlas seleccionada.

Las posiciones de las células registradas para cada animal se resumieron utilizando cellfinder33. Los recuentos de células se combinaron para estructuras corticales laminadas. Los recuentos de células ipsilaterales y contralaterales se analizaron como regiones separadas. En un control ileso (inyección en hipocampo), se encontró una pequeña cantidad de células marcadas con rabia cerca del tracto de inyección en el neocórtex suprayacente. Estas células fueron excluidas del análisis ya que fueron marcadas por la inyección de la aguja, no por la propagación transináptica del virus. Cada área individual del cerebro utilizada para la cuantificación y su abreviatura dentro del atlas Allen CCF se proporcionan en Datos complementarios 2. Para el cálculo de la distancia euclidiana, el centroide de la célula inicial se calculó promediando las coordenadas del atlas de cada célula inicial registrada y redondeando el resultado al más cercano. entero. La distancia euclidiana tridimensional se calculó entre el centriodo de la célula iniciadora y cada posición de neurona de entrada presináptica utilizando la siguiente fórmula:

donde (x2,y2,z2) representa AP, ML y DV del centriodio de la célula iniciadora, (x1,y1,z1) representa AP, ML y DV de cada posición de célula presináptica registrada y d representa la longitud de la distancia calculada vector. Para el análisis de las distancias AP y DV, los recuentos de células se agruparon a intervalos de 200 μm y se normalizaron al número total de células de cada animal. Para el análisis de la distancia ML, los recuentos de células se agruparon a 100 μm para producir un número par de contenedores para cada hemisferio. Las estimaciones de la densidad del núcleo gaussiano se calcularon utilizando un script de Python marino y el ancho de banda se estableció en 0,5.

Las muestras aclaradas se retiraron de DBE y se lavaron en DCM dos veces durante 15 min, seguido de una incubación durante la noche en 2:1 DCM/MeOH. A continuación, las muestras se rehidrataron en MeOH/agua al 100 %, 80 %, 60 %, 40 %, 20 % y PBS 0,1 M durante 1 h cada una en un agitador orbital (115 RPM) a temperatura ambiente. Las secciones de vibratomo de flotación libre (50 μm) se cortaron utilizando un vibratomo a temperatura ambiente en PBS 0,1 M que contenía Triton-X al 0,05%. Puede encontrar un protocolo paso a paso para la compensación inversa en: https://github.com/roberthuntlab/clearedbrainanalysis.

Los ratones se perfundieron transcardiacamente con paraformaldehído al 4 % (v/v) y las secciones de vibratomo de flotación libre (50 μm) se procesaron utilizando procedimientos estándar de inmunotinción51. Los anticuerpos primarios fueron los siguientes: proteína fluorescente anti-verde de pollo (GFP; 1:1000; Aves, n.º de cat. GFP1020), anti-mCherry de pollo (1:1000; Abcam, n.º de cat. ab205402), anticolina acetiltransferasa de cabra ( CHAT; 1:500; Millipore, n.° de cat. AB144P), antirreelina de ratón (1:500; Millipore, n.° de cat. MAB5364, clon G10), anti-DsRed de conejo (1:1000; Clontech, n.° de cat. 632496) , anti-somatostatina de conejo (SST; 1:200; Santa Cruz, nº de cat. SC-7819) y anti-WFS1 de conejo (1:1000; Protein Tech, nº de cat. 11558-1-AP). Todos los anticuerpos se han utilizado previamente para el análisis de inmunotinción en el cerebro. Para los anticuerpos secundarios (1:1000, Life Technologies), utilizamos anticuerpos de cabra conjugados con Alexa 488 contra IgG de pollo (n.º de cat. A11039), anticuerpos de cabra contra IgG de ratón (n.º de cat. A11029), anticuerpos de burro contra IgG de cabra ( nº de catálogo A11055); Anticuerpo de cabra conjugado con Alexa 546 contra IgG de conejo (n.º de cat. A11035), anticuerpo de burro contra IgG de conejo (n.º de cat. A10040), anticuerpo de burro contra IgG de cabra Alexa 594 (n.º de cat. A11058) y conjugado con Alexa 647 anticuerpo de cabra contra IgG de pollo (cat. n.º A32933). Luego, las secciones se montaron en portaobjetos cargados (Superfrost plus, Fisher Scientific) con Fluoromount-G que contenía DAPI. Las imágenes confocales se obtuvieron con un microscopio de barrido láser Olympus FV3000. Las imágenes epifluorescentes se obtuvieron utilizando un microscopio Leica DM6 con el software Leica LAS X. El brillo y el contraste se ajustaron manualmente usando Image J, según fuera necesario.

Se tomaron imágenes de secciones marcadas con fluorescencia (50 μm) usando un microscopio Leica DM6 con un objetivo de ×10 o ×20 o un microscopio confocal Olympus FV3000 con un objetivo de ×20 o ×40 y se contaron usando FIJI (ImageJ)51. Todas las células que expresaron un marcador fluorescente se contaron en cada sexta sección a lo largo de todo el cerebro (es decir, con una separación de 300 μm). Todas las secciones que contenían células marcadas se analizaron por animal y se promediaron los valores para obtener una densidad celular media (células/mm2).

Los ratones se perfundieron transcardiacamente con paraformaldehído al 4% (v/v) y las secciones de vibratomo de flotación libre (50 μm) se procesaron para la tinción con fluoro-jade C de acuerdo con las instrucciones del fabricante91. Brevemente, las secciones de cerebro se secaron en portaobjetos recubiertos de gelatina durante 30 min a 50 °C. Los portaobjetos se sumergieron en NaOH al 1 % en etanol al 80 % durante 5 min, etanol al 70 % durante 2 min, dH2O durante 2 min, permanganato de potasio al 0,06 % durante 10 min, dH2O durante 2 min, 0,00015 % de fluoro-jade C (Histo-Chem Inc., nº de catálogo 1FJC) y DAPI al 0,0001 % en ácido acético al 0,1 % durante 10 min, seguido de tres lavados en dH2O durante 1 min cada uno. A continuación, los portaobjetos se secaron a 50 °C durante 5 min y se aclararon en xilenos antes de cubrirlos con medio de montaje Eukitt (Sigma, nº de cat. 03989).

Las capas ventricular y subventricular del MGE se recolectaron de embriones E13.5. El punto de tiempo en el que se detectó el tapón de esperma se consideró E0.5. Los explantes embrionarios de MGE se diseccionaron en medio Leibovitz L-15, se disociaron mecánicamente mediante pipeteo repetido en medio L-15 y se concentraron mediante centrifugación (3 min a 600 × g). Las suspensiones de células concentradas se cargaron frontalmente en micropipetas de vidrio biselado (diámetro de punta de 50 μm, Wiretol 5 μl, Drummond Scientific) y se inyectaron (3 × 104 células por inyección) en el hipocampo de ratones adultos con lesión cerebral 7 días después de la lesión CCI. Se realizaron inyecciones de células en el estrato radiatum del subcampo CA3 en las siguientes coordenadas estereotáxicas: AP -2,0 mm, ML 2,45 mm, DV -1,8 mm.

Todas las pruebas estadísticas se realizaron con Graphpad Prism 9, R y Microsoft Excel. Los tamaños de muestra se basaron en publicaciones previas38,47,92. Para los análisis cuantitativos de todo el cerebro, el número de neuronas de entrada en cada área distinta del cerebro se normalizó al número total de neuronas de entrada detectadas en todo el cerebro (% de entrada) o al número total de células iniciadoras (índice de convergencia). Los datos se compararon mediante la prueba t de Student de dos colas, ANOVA de una vía seguido de una prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples, ANOVA de dos vías seguido de una prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples, ANOVA de medidas repetidas de dos vías seguido por una prueba post hoc de Bonferroni, análisis de Chi-Cuadrado o prueba exacta de Fisher. El análisis UMAP y la correlación de Pearson se calcularon en R. Los datos se expresan como media ± SEM, n = animales a menos que se especifique lo contrario y la significancia se fijó en P < 0,05. Para obtener una lista completa de pruebas y resultados estadísticos, consulte Datos complementarios 1 a 9 y Datos de origen.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos generados en este estudio se proporcionan en el archivo de información complementaria y datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Los scripts de Python personalizados están disponibles en: https://github.com/roberthuntlab/clearedbrainanalysis.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01–NS096012 (RFH), F31–NS106806 (JCF) y R01–EY024890 (DCL), becas del Programa de Investigación de Pregrado de Verano (SURP) de UCI (SP y QC ) y fue posible en parte gracias al acceso a la Instalación central de biología óptica del Centro de biología del desarrollo, un recurso compartido respaldado por la Subvención de apoyo del Centro de cáncer (CA-62203) y la Subvención de apoyo del Centro para sistemas biológicos complejos (GM-076516) en el Universidad de California, Irvine. Este trabajo también fue apoyado por GT3 Core Facility del Salk Institute con financiamiento de NIH-NCI CCSG: P30-014195, una subvención NINDS R24 Core y financiamiento de NEI. Agradecemos al Dr. Charles Ribak y a los miembros del laboratorio de Hunt por sus valiosos debates y comentarios sobre las versiones anteriores de este manuscrito.

Estos autores contribuyeron igualmente: Jan C. Frankowski, Alexa Tierno.

Departamento de Anatomía y Neurobiología, Universidad de California, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

Jan C. Frankowski, Alexa Tender, Shreya Pavani, Quincy Cao, David C. Lyon y Robert F. Hunt

Centro de Investigación de Epilepsia, Universidad de California, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

robert f caza

Sue and Bill Gross Stem Cell Research Center, Universidad de California, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

robert f caza

Centro de Neurobiología del Aprendizaje y la Memoria, Universidad de California, Irvine, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

robert f caza

Centro de Mapeo de Circuitos Neurales, Universidad de California, Irvine, Irvine, CA, 92697, EE. UU.

robert f caza

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JCF y AT hicieron contribuciones iguales, y estos autores se enumeran en orden alfabético. JCF realizó inmunotinción, limpieza cerebral iDISCO+, imágenes confocales y de láminas de luz; escribió código Python; realizó cuantificaciones de conteo de células y análisis de datos iniciales; contribuyó con fondos de becas y escribió borradores para partes de los métodos y cifras iniciales. AT realizó imágenes de inmunotinción, confocal y de hoja de luz; código Python editado; realizó cuantificaciones de conteo de células y análisis de datos finales; recopiló datos de origen, cifras finales y editó el manuscrito. SP realizó histología, análisis de datos y editó el manuscrito. QC realizó el análisis de datos y editó el manuscrito. DCL contribuyó con fondos, virus de la rabia y editó el manuscrito. RFH contribuyó al concepto, diseño, ejecución y análisis de todos los experimentos, la financiación y escribió el manuscrito.

Correspondencia a Alexa Tender o Robert F. Hunt.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a MacKenzie Howard, Chris Dulla y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Frankowski, JC, Tender, A, Pavani, S et al. Reconstrucción de circuitos inhibitorios en todo el cerebro después de una lesión cerebral traumática. Nat Comun 13, 3417 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31072-2

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Recibido: 11 noviembre 2021

Aceptado: 31 de mayo de 2022

Publicado: 14 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31072-2

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