Un módulo de interacción ancestral promueve la oligomerización en ATP sintasas mitocondriales divergentes

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 5989 (2022) Citar este artículo

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La ATP sintasa mitocondrial forma dímeros estables dispuestos en ensamblajes oligoméricos que generan la curvatura de la membrana interna esencial para una conversión de energía eficiente. Aquí, informamos estructuras crio-EM del dímero ATP sintasa intacto de Trypanosoma brucei en diez estados rotacionales diferentes. El modelo consta de 25 subunidades, incluidas nueve específicas de linaje, así como 36 lípidos. El mecanismo de rotación está influenciado por el tallo periférico divergente, lo que le confiere una mayor flexibilidad conformacional. La transferencia de protones en el medio canal lumenal se produce a través de una cadena de cinco moléculas de agua ordenadas. La interfaz de dimerización está formada por la subunidad g que es crítica para las interacciones pero no para la actividad catalítica. Aunque la arquitectura general del dímero varía entre los eucariotas, encontramos que la subunidad-g junto con la subunidad-e forman un motivo de oligomerización ancestral, que se comparte entre los linajes tripanosómicos y de mamíferos. Por lo tanto, nuestros datos definen el módulo de la subunidad g/e como un componente estructural que determina los ensamblajes oligoméricos de la ATP sintasa.

La ATP sintasa mitocondrial consta de los subcomplejos F1 soluble y Fo unido a la membrana y se presenta en dímeros que se ensamblan en oligómeros para inducir la formación de pliegues en la membrana interna, llamados crestas. Las crestas son los sitios de fosforilación oxidativa y conversión de energía en las células eucariotas. La disociación de dímeros de ATP sintasa en monómeros da como resultado la pérdida de la arquitectura de las crestas nativas y deteriora la función mitocondrial1,2. Si bien la morfología de las crestas varía sustancialmente entre organismos de diferentes linajes, desde lamelares planas en opisthokonts hasta tubulares enrolladas en ciliados y discoidales en euglenozoans3, los dímeros de ATP sintasa mitocondrial representan una ocurrencia universal para mantener la forma de la membrana4.

Los dímeros de ATP sintasa de tamaño y arquitectura variables, clasificados en los tipos I a IV, se han resuelto recientemente mediante estudios crio-EM de alta resolución. En la estructura del dímero de ATP sintasa de tipo I de los mamíferos, los monómeros solo están débilmente asociados5,6, y en las inserciones de levadura en las subunidades de membrana forman contactos más estrechos7. La estructura del dímero ATP sintasa tipo II del alga Polytomella sp. mostró que la interfaz del dímero está formada por componentes específicos del filo8. El dímero de ATP sintasa tipo III del ciliado Tetrahymena thermophila se caracteriza por ejes de rotación paralelos, y se identificaron una subunidad subestequiométrica, así como múltiples lípidos en la interfaz del dímero, mientras que los componentes proteicos adicionales que unen a los monómeros se distribuyen entre la matriz. regiones luminales, transmembrana y 9. La estructura de la ATP sintasa tipo IV con lípidos nativos de Euglena gracilis también mostró que interacciones específicas proteína-lípido contribuyen a la dimerización, y que los tallos central y periférico interactúan entre sí directamente10. Finalmente, una ATP sintasa apicompleja única se dimeriza a través de 11 componentes específicos del parásito que contribuyen con ~7000 Å2 de área de superficie enterrada11 y, a diferencia de todas las demás ATP sintasas, que se ensamblan en filas, se asocia en estados oligoméricos superiores de pirámides pentagonales en las regiones curvas de la membrana apical. . Juntos, los datos estructurales disponibles sugieren una diversidad de oligomerización, y aún se desconoce si existen elementos comunes que median en estas interacciones o si la dimerización de la ATP sintasa ocurrió de forma independiente y varias veces en la evolución4.

La ATP sintasa de Trypanosoma brucei, un representante de los cinetoplastos y un organismo modelo médicamente importante establecido que causa la enfermedad del sueño, es muy divergente, ejemplificado por la cabeza F1 en forma de pirámide que contiene una subunidad específica del filo12,13. Los dímeros son sensibles a la falta de cardiolipina14 y forman segmentos helicoidales zurdos cortos que se extienden a través de la cresta de la membrana de las crestas discoidales15. Únicamente entre los eucariotas aeróbicos, la etapa del ciclo de vida de los mamíferos de T. brucei utiliza el modo inverso de la ATP sintasa, utilizando la enzima como bomba de protones para mantener el potencial de la membrana mitocondrial a expensas del ATP16,17. Por el contrario, las etapas de insecto del parásito emplean el modo directo de producción de ATP de la enzima18,19.

Dada la conservación de las subunidades centrales, la naturaleza diferente de la oligomerización y la capacidad de probar hipótesis estructurales bioquímicamente, razonamos que la investigación de la estructura y función de la ATP sintasa de T. brucei proporcionaría el eslabón evolutivo faltante para comprender cómo interactúan los monómeros para formar dímeros fisiológicos.

Aquí, abordamos esta pregunta combinando el análisis estructural, funcional y evolutivo del dímero de ATP sintasa de T. brucei.

Purificamos dímeros de ATP sintasa de tripomastigotes procíclicos de T. brucei cultivados mediante cromatografía de afinidad con un inhibidor de proteína natural recombinante TbIF120 y sometimos la muestra a análisis crio-EM (Figuras complementarias 1 y 2). Usando refinamientos enmascarados, se obtuvieron mapas para la región de la membrana, el rotor y el tallo periférico. Para describir el espacio conformacional de la ATP sintasa de T. brucei, resolvimos diez subestados rotatorios distintos, que se refinaron a una resolución de 3,5 a 4,3 Å. Finalmente, se seleccionaron partículas con ambos monómeros en estado rotacional 1, y la estructura de consenso del dímero se refinó a una resolución de 3.2 Å (Tabla complementaria 1, Figuras complementarias 2 y 3).

A diferencia de la arquitectura de gran angular de los dímeros que se encuentran en animales y hongos, la ATP sintasa de T. brucei muestra un ángulo de 60° entre los dos subcomplejos F1/anillo c. El modelo de la ATP sintasa de T. brucei incluye las 25 subunidades diferentes, nueve de las cuales son específicas del linaje (Fig. 1a, Fig. 4 complementaria y Película complementaria 1). Nombramos las subunidades de acuerdo con la nomenclatura propuesta previamente21,22,23 (Tabla complementaria 2). Además, identificamos y modelamos 36 fosfolípidos unidos, incluidas 24 cardiolipinas (Fig. 5 complementaria). Ambos detergentes utilizados durante la purificación, n-dodecil β-D-maltósido (β-DDM) y glico-diosgenina (GDN) también se resuelven en la periferia de la región de la membrana (Fig. 6 complementaria).

a Vistas frontal y lateral del modelo compuesto con ambos monómeros en estado de rotación 1. Los dos complejos de anillos F1/c10, cada uno aumentado por tres copias de la subunidad p18 específica del filo, están unidos en un ángulo de 60°. La región Fo unida a la membrana muestra una arquitectura única y está compuesta por subunidades conservadas y específicas del filo. b Vista lateral de la región Fo que muestra la interacción luminal del barril β de diez hebras del anillo c (gris) con ATPTB12 (azul pálido). Se indica la cavidad Fo periférica llena de lípidos. c Vista de primer plano de los lípidos unidos dentro de la cavidad Fo periférica que muestra la densidad crio-EM. d Vista superior del anillo c decamérico con un trifosfato de ribonucleósido de pirimidina unido, asignado como UTP, aunque no detectado experimentalmente. La densidad del mapa se muestra en azul transparente, se muestran los residuos que interactúan.

En la región catalítica, F1 aumenta con tres copias de la subunidad p18, cada una unida a la subunidad-α12,13. Nuestra estructura muestra que p18 está involucrada en la unión inusual de F1 al tallo periférico. La región de la membrana incluye ocho subunidades Fo conservadas (b, d, f, 8, i/j, k, eyg) dispuestas alrededor de la subunidad a del translocador de protones central. Identificamos esas subunidades en función de la similitud estructural y la topología coincidente con sus contrapartes de levadura (Fig. 2). Para la subunidad-b, una sola hélice transmembrana se superpone bien con bH1 de la levadura y ancla las subunidades-e y -g al Fo (Fig. 2a, b). En la levadura y la ATP sintasa bovina bH1 y las hélices transmembrana de las subunidades -e y -g están dispuestas de la misma manera que en nuestra estructura y contribuyen a una cuña característica en el dominio de la membrana5. La hélice larga bH2, que constituye la parte central del tallo periférico en otros organismos, está ausente en T. brucei (Fig. 2c). No se encuentra ninguna subunidad-b24 alternativa en nuestra estructura.

a Vista superior de la región de la membrana con subunidades de T. brucei (en color) superpuestas con estructura de S. cerevisiae (gris transparente). La superposición estructural cercana y la topología coincidente permitieron la asignación de subunidades conservadas en función de la topología y la ubicación coincidentes. b La superposición de las subunidades -b, -e y -g con sus equivalentes de S. cerevisiae PDB 6B2Z (ATP sintasa mitocondrial de S. cerevisiae) confirma su identidad. c Representación esquemática de las hélices transmembrana de la subunidad-b y las subunidades adyacentes en T. brucei, E. gracilis PDB 6TDV (ATP sintasa mitocondrial de E. gracilis, región de la membrana)10 y S. cerevisiae PDB 6B2Z (ATP sintasa mitocondrial de S. cerevisiae)7 ATP sintasas. PC – fosfatidilcolina.

La región de la membrana contiene un subcomplejo periférico, formado principalmente por ATPTB1,6,12 y ATPEG3 específicos del filo (Fig. 1b). Está separado del núcleo conservado por una cavidad intrínseca a la membrana, en la que se resuelven nueve cardiolipinas unidas (Fig. 1c), y el extremo C de ATPTB12 interactúa con el barril β lumenal del anillo c10. El barril β, que también se informó anteriormente en la ATP sintasa de E. gracilis10, se extiende desde el anillo c10 aproximadamente 15 Å hasta la luz (Fig. 1a y Fig. 7 complementaria). La cavidad del anillo c decamérico contiene una densidad consistente con lípidos desordenados, como se observa en otras ATP sintasas5,6,7, y además, cerca del lado de la matriz, 10 residuos de Arg66c coordinan una densidad de ligando, que es consistente con un trifosfato de ribonucleósido de pirimidina (Figura 1d). Asignamos esta densidad como trifosfato de uridina (UTP), debido a su gran requerimiento en el metabolismo del ARN mitocondrial de los tripanosomas africanos, siendo un sustrato para la edición postranscripcional del ARN25 y la adición de colas de poliuridina a los gRNA y rRNA26,27, como así como por la baja abundancia de citidina trifosfato (CTP)28. La base de nucleótidos se inserta entre dos residuos Arg82c, mientras que la región trifosfato está coordinada por otros cinco residuos Arg82c, con Tyr79δ y Asn76δ proporcionando contactos de coordinación asimétricos. La presencia de un nucleótido dentro del anillo c es sorprendente, dados los informes recientes de fosfolípidos dentro de los anillos c en mamíferos5,6 y ciliados9, lo que indica que una gama de diferentes ligandos puede proporcionar un andamiaje estructural.

El tallo periférico tripanosómico muestra una arquitectura marcadamente diferente en comparación con sus contrapartes de levadura y mamíferos. En los complejos de opistoconto, el tallo periférico se organiza alrededor del bH2 largo, que se extiende desde la membrana ~15 nm hacia la matriz y se une al OSCP en la parte superior de F15,7. Por el contrario, T. brucei carece del bH2 canónico y, en cambio, las hélices 5-7 de la subunidad d divergente y la hélice C-terminal de la subunidad-8 extendida se unen a una extensión C-terminal de OSCP en la parte apical del tallo periférico. (Figura 3a). La interacción entre OSCP y la subunidad-d y -8 se estabiliza por ATPTB3 y ATPTB4 solubles. El tallo periférico está enraizado en el subcomplejo de la membrana por una hélice transmembrana de la subunidad 8, envuelta en el lado de la matriz por las hélices 8-11 de la subunidad d. Además de los contactos canónicos en la parte superior de F1, el tallo periférico está unido a F1 a través de una extensión C-terminal de OSCP específica de euglenozoa, que contiene un enlazador desordenado y una horquilla de hélice terminal que se extiende entre el p18 unido a F1 y las subunidades. -d y -8 del tallo periférico (Fig. 3a y Películas complementarias 2, 3). Otra interacción de F1 con el tallo periférico ocurre entre las hélices C-terminales apiladas de la subunidad-β y -d (Fig. 3b), la última de las cuales pertenece estructuralmente a F1 y está conectada al tallo periférico a través de un conector flexible.

una extensión OSCP N-terminal proporciona una unión de tallo central permanente, mientras que la extensión C-terminal proporciona una unión específica del filo al tallo periférico divergente. b Las hélices C-terminales de las subunidades -β y -d proporcionan una unión F1 permanente. c Subpasos del anillo c durante la transición del estado de rotación 1 al 2. d Pasos de acomodación del movimiento F1 que se muestran en (c). Después de avanzar junto con el rotor al estado 1e, el F1 gira en la dirección opuesta al pasar al estado 2a. e Movimiento basculante de F1 y flexión acomodativa del tallo periférico.

Para evaluar si la arquitectura inusual del tallo periférico influye en el mecanismo de rotación, analizamos 10 clases que representan diferentes estados de rotación. Los tres estados principales (1–3) resultan de tres pasos de rotación de ~120° del rotor en relación con el Fo estático. En todas las clases, F1 tiene una conformación similar, correspondiente a la permanencia catalítica, observada previamente también en la estructura cristalina de T. brucei F1-ATPase13. De acuerdo con la rotación de ~120° del tallo central, las conformaciones y la ocupación de nucleótidos de las interfaces catalíticas de los dímeros αβ individuales difieren entre los estados principales, mostrando ADP y ATP en las conformaciones cerradas "sueltas" y "apretadas", respectivamente. , y sitio de unión de nucleótido vacío en la conformación "abierta". Identificamos cinco (1a–1e), cuatro (2a–2d) y una (3) clases de los respectivos estados principales. Las posiciones del rotor de los estados rotacionales 1a, 2a y 3 están relacionadas por pasos de 117°, 136° y 107°, respectivamente. A lo largo de todos los subpasos identificados del estado rotacional 1 (clases 1a a 1e), el rotor gira ~33°, lo que corresponde aproximadamente al avance de una subunidad-c del anillo c10 (Fig. 3c). Mientras gira junto con el rotor, el casco F1 se queda atrás, avanzando solo ~13°. Durante la siguiente transición de 1e a 2a, el rotor avanza ~84°, mientras que el cabezal F1 gira ~22° en la dirección opuesta (Fig. 3d). Esto genera un par de torsión contradireccional entre los dos motores, que es consistente con un mecanismo de carrera de potencia. Este par contradireccional puede ocurrir en las tres principales transiciones de estado de rotación. Sin embargo, solo se observó en el estado principal 1, porque se capturó en más subpasos que en los dos estados restantes, presumiblemente como consecuencia del desajuste de simetría entre el anillo c decamérico y el hexámero α3β329. Dentro de las cuatro clases del estado 2 el rotor avanza 23° y F1 regresa cerca de su posición observada en la clase 1a, donde se encuentra también en la única clase observada del estado 3. Aunque con pequeñas diferencias en el tamaño del paso, este El mecanismo es consistente con una observación previa en la Polytomella ATP sintasa8. Sin embargo, debido a su tallo periférico grande y rígido, la ATP sintasa de Polytomella muestra principalmente subpasos rotacionales, mientras que el Trypanosoma F1 también muestra un movimiento de inclinación de ~ 8 ° revelado por los estados rotatorios 1a y 1b (Fig. 3e y Película complementaria 2). El movimiento de bisagra informado anteriormente entre los dominios N- y C-terminal de OSCP8 no se encuentra en nuestras estructuras; en cambio, los cambios conformacionales del subcomplejo de anillo F1/c10 se acomodan mediante una flexión de 5° de la parte apical del periférico. acechar. (Fig. 3e y Películas Suplementarias 2, 3). Juntos, los datos estructurales indican que la unión del tallo periférico divergente confiere una mayor flexibilidad conformacional a la ATP sintasa de T. brucei.

El mecanismo de translocación de protones implica la protonación secuencial de E102 de las subunidades-c, la rotación del anillo c10 con E102c neutralizado expuesto a la bicapa de fosfolípidos y la liberación de protones en el otro lado de la membrana. Los sitios de unión y liberación de protones están separados por el R146 conservado aportado por la hélice horizontal H5 de la subunidad-a y son accesibles desde el lumen de las crestas y la matriz mitocondrial mediante medios canales acuosos (Fig. 4a). Juntos, R146 y el N209 adyacente coordinan un par de moléculas de agua entre las hélices H5 y H6 (Fig. 4b). Se ha observado una coordinación similar en la politomella ATP sintasa8. La coordinación del agua probablemente restringe el R146 a los rotámeros que se extienden hacia el anillo en C, con el que se cree que interactúa.

una Subunidad-a (verde) con los canales matriz (naranja) y lumenal (azul claro), y una fosfatidilcolina ordenada (PC1; azul). E102 del anillo c10 mostrado en gris. b Vista de primer plano de los altamente conservados R146a y N209a, que coordinan dos moléculas de agua entre las hélices H5-6a. c Vista lateral del canal lumenal con la vía de los protones (azul claro) y la fosfatidilcolina de confinamiento (azul). d Cadena de moléculas de agua ordenadas en el canal lumenal. Las distancias entre W1–W5 (rojo) son 5,2, 3,9, 7,3 y 4,8 Å, respectivamente. e Las aguas ordenadas se extienden hasta H155a, lo que probablemente media en la transferencia de protones a D202a.

En nuestra estructura, el medio canal luminal, que muestra una resolución local de 2,55 Å (Fig. 3 complementaria), está lleno de una red de densidades de agua resueltas, que termina en una cadena de cinco moléculas de agua ordenadas (W1–W5; Fig. .4c–e). La presencia de moléculas de agua ordenadas en el canal acuoso es consistente con un mecanismo tipo Grotthuss para la transferencia de protones, que no requeriría la difusión a larga distancia de moléculas de agua5. Sin embargo, debido a que algunas distancias entre las moléculas de agua observadas son demasiado grandes para el enlace de hidrógeno directo, la transferencia de protones puede involucrar moléculas de agua tanto coordinadas como desordenadas. La distancia de 7 Å entre la última agua resuelta (W1) y D202a, el residuo conservado que se cree que transfiere protones al anillo c, es demasiado larga para la transferencia directa de protones. En cambio, puede ocurrir a través del H155a adyacente. Por lo tanto, nuestra estructura resuelve elementos individuales que participan en el transporte de protones (Fig. 4d, e).

El medio canal de protones luminal en la ATP sintasa de mamífero5,6 y apicomplexan11 está revestido por la parte transmembrana de bH2, que está ausente en T. brucei. En cambio, la posición de bH2 está ocupada por una fosfatidilcolina completamente ordenada en nuestra estructura (PC1; Fig. 4a, c). Por lo tanto, un lípido unido reemplaza un elemento proteico en la ruta de los protones.

A pesar de compartir un conjunto de subunidades Fo conservadas, el dímero de ATP sintasa de T. brucei muestra una arquitectura de dímero marcadamente diferente en comparación con las estructuras previamente determinadas. En primer lugar, su interfaz de dimerización de 3600 Å2 es más pequeña que la de las ATP sintasas de E. gracilis tipo IV (10 000 Å2) y T. thermophila tipo III (16 000 Å2). En segundo lugar, a diferencia de la ATP sintasa de mamíferos y hongos, en la que los tallos periféricos se extienden en el plano definido por los dos ejes de rotación, en nuestra estructura los monómeros giran de tal manera que los tallos periféricos se desplazan lateralmente en los lados opuestos del plano. Debido a los monómeros rotados, esta arquitectura está asociada con una interfaz de dimerización específica, donde dos copias de la subunidad g interactúan homotípicamente en el eje de simetría C2 (Fig. 5a y Película complementaria 1). Ambas copias de H1-2g se extienden horizontalmente a lo largo del lado de la matriz de la membrana, apretándose entre sí (Fig. 5c, e). Esto facilita la formación de contactos entre una hélice transmembrana asociada de la subunidad -e con el monómero vecino a través de la subunidad -a' en la membrana y -f' en la luz, contribuyendo así aún más a la interfaz (Fig. 5b). Por lo tanto, el dímero de ATP sintasa se ensambla a través del módulo de subunidad-e/g. La parte C-terminal de la hélice de la subunidad-e se extiende hacia la luz, hacia el barril β de diez hebras del anillo c (Fig. 7a complementaria). Los residuos terminales 23 están desordenados con una densidad mal resuelta que se conecta al tapón de detergente del barril β del anillo c (Fig. 7b complementaria). Esto se parece al extremo C-terminal de la luz de la subunidad-e en la estructura bovina5, lo que indica una interacción conservada con el anillo c. En los mamíferos, se ha propuesto un mecanismo en el que la retracción de la subunidad e tras la exposición al calcio extrae el tapón de lípidos e induce el desmontaje del anillo c, lo que desencadena la apertura del poro de transición de permeabilidad (PTP)6.

a Vista lateral con subunidades dimerizantes coloreadas. La interfaz del dímero está constituida por la subunidad b-e' en contacto con la subunidad-a en la membrana y la subunidad-f en el lumen, las subunidades c eyg de ambos monómeros forman un subcomplejo con lípidos unidos. d La subunidad g y -e forman un motivo de dimerización en el dímero de ATP sintasa tripanosómica (tipo IV) (este estudio), el mismo elemento estructural forma el motivo de oligomerización en el tetrámero de ATP sintasa porcina. La similitud estructural del pseudodímero (es decir, dos monómeros diagonales de dímeros adyacentes) en la estructura porcina con el dímero tripanosómico sugiere que los dímeros de ATP sintasa tipo I y IV han evolucionado a través de la divergencia de un ancestro común. e Las estructuras diméricas de la subunidad e/g se conservan en Sus scrofa PDB 6ZNA (ATP sintasa mitocondrial de S. scrofa) y T. brucei (este trabajo) y contienen un motivo GXXXG conservado (naranja) que media la interacción de las hélices transmembrana. f Modelos de los dímeros de ATP sintasa ajustados en promedios de subtomogramas de oligómeros cortos15: vista de matriz, izquierda; corte transversal, centro, vista luminal, derecha; EMD-3560 (estructura in situ de la ATP sintasa mitocondrial de T. brucei).

El módulo e / g se mantiene unido por cuatro cardiolipinas unidas en el folleto de matriz, anclándolo a la región Fo restante (Fig. 5c). Los grupos de cabeza de los lípidos están coordinados por residuos polares y cargados con sus cadenas de acilo llenando una cavidad central en la región de la membrana en la interfaz del dímero (Fig. 5c y Fig. 5f complementaria). Se ha informado previamente que la unión de cardiolipina es obligatoria para la dimerización en transportadores secundarios30 y el agotamiento de la cardiolipina sintasa resultó en niveles reducidos de ATP sintasa en los tripanosomas del torrente sanguíneo14.

Curiosamente, para las levaduras, los primeros estudios de electroforesis en gel nativo azul31 y de promedio de subtomograma2 sugirieron que la subunidad-g es potencialmente mediadora del dímero, sin embargo, los módulos e/g están ubicados lateralmente opuestos a ambos lados del eje largo del dímero, en la periferia del complejo. ~ 8,5 nm de distancia entre sí. Debido a que los módulos e/g no interactúan directamente dentro del dímero ATP sintasa de levadura, se ha propuesto que sirvan como elementos de flexión de membrana, mientras que los principales contactos del dímero están formados por la subunidad -a y -i/j7. En los mamíferos, el módulo e/g ocupa la misma posición que en las levaduras, formando la interacción entre dos monómeros diagonales en un tetrámero5,6,32, así como entre dímeros paralelos33. La comparación con nuestra estructura muestra que la organización general del módulo e / g de mamífero intradimérico tripanosómico e interdimérico es estructuralmente similar (Fig. 5d). Además, los parásitos cinetoplástidos y los mamíferos comparten motivos GXXXG conservados en la subunidad-e34 y -g (Fig. 8 complementaria), que permiten una estrecha interacción de sus hélices transmembrana (Fig. 5e), lo que proporciona más evidencia de la homología de la subunidad. Sin embargo, mientras que los dímeros de ATP sintasa de mamíferos están dispuestos perpendicularmente al eje largo de sus filas a lo largo del borde de las crestas35, los dímeros de T. brucei en los bordes de las crestas discoidales están inclinados ~45° con respecto al eje de la fila15. Por lo tanto, el módulo e/g ocupa posiciones equivalentes en las filas de ambos grupos distantes evolutivos (Fig. 5f y ref. 33).

Para validar los conocimientos estructurales, derribamos cada subunidad Fo individual mediante interferencia de ARN inducible (ARNi). Todos los ARNm objetivo cayeron al 5-20% de sus niveles originales después de dos y cuatro días de inducción (Fig. 6a y Fig. 9a complementaria). El análisis de transferencia Western de lisados de células completas resueltos mediante electroforesis desnaturalizante reveló niveles reducidos de subunidades Fo ATPB1 y -d, lo que sugiere que la integridad del resto Fo depende de la presencia de otras subunidades Fo (Fig. 6c, d). La inmunotransferencia de complejos mitocondriales resueltos por electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE) con anticuerpos contra las subunidades F1 y Fo reveló una fuerte disminución o pérdida casi completa de formas diméricas y monoméricas de ATP sintasas cuatro días después de la inducción de ARNi de la mayoría de las subunidades (b , e, f, i/j, k, 8, ATPTB3, ATPTB4, ATPTB6, ATPTB11, ATPTB12, ATPEG3 y ATPEG4), lo que documenta una mayor inestabilidad de la enzima o defectos en su ensamblaje. La acumulación simultánea en F1-ATPasa, según lo observado por BN-PAGE, demostró que el resto catalítico permanece intacto después de la interrupción del tallo periférico o el subcomplejo de membrana (Fig. 6b-d y Fig. 9b complementaria).

a Curvas de crecimiento de líneas celulares de ARNi no inducidas (líneas continuas) e inducidas por tetraciclina (líneas discontinuas) cultivadas en presencia (negro) o ausencia (marrón) de glucosa. Los recuadros muestran los niveles relativos del ARNm diana respectivo en los días indicados después de la inducción (DPI) normalizados a los niveles de ARNr 18S (barras negras) o β-tubulina (barras blancas). b Inmunotransferencias de lisados mitocondriales de las líneas celulares de ARNi indicadas resueltas mediante BN-PAGE sondeadas con anticuerpos contra las subunidades de ATP sintasa indicadas (n = 2). Se muestran las posiciones del marcador de peso molecular (MW). c Inmunotransferencias de lisados de células enteras de las líneas celulares de ARNi indicadas sondadas con los anticuerpos indicados (n = 3). Se muestran las posiciones del marcador MW. d Cuantificación de tres réplicas independientes de inmunotransferencias en (c). Los valores se normalizaron a la señal del control de carga Hsp70 ya las células no inducidas. Los gráficos muestran valores individuales, medias y desviaciones estándar (DE; barras de error).

En contraste con las otras subunidades Fo específicas, la regulación a la baja de la subunidad-g con RNAi resultó en una pérdida específica de complejos diméricos con la acumulación concomitante de monómeros (Fig. 6b), lo que indica que se requiere para la dimerización, pero no para el ensamblaje y estabilidad de las unidades monoméricas F1Fo ATP sintasa. La microscopía electrónica de transmisión de secciones de células delgadas reveló que la monomerización de ATP sintasa en la línea celular subunidad-gRNAi tuvo el mismo efecto en la ultraestructura mitocondrial que la pérdida casi completa de monómeros y dímeros tras la eliminación de la subunidad-8. Ambas líneas celulares exhibieron recuentos de crestas disminuidos y morfología de crestas aberrante (Fig. 7a, b), incluida la aparición de formas redondas que recuerdan a las estructuras detectadas tras la eliminación de la subunidad-g o -e en Saccharomyces cerevisiae1. Estos resultados indican que la monomerización evita que la ATP sintasa tripanosómica se ensamble en filas helicoidales cortas en los bordes de las crestas discoidales15, como se ha informado para la oligomerización alterada en contrapartes de otros eucariotas2,36.

a Micrografías electrónicas de transmisión de secciones de líneas celulares de ARNi no inducidas o inducidas durante 4 días. Se obtuvieron al menos 70 micrografías en cada categoría. Las membranas mitocondriales y las crestas están marcadas con puntas de flecha azules y rojas, respectivamente. El panel superior muestra ejemplos de secciones transversales irregulares, alargadas y redondas de mitocondrias cuantificadas en (b). Barras de escala: 500 nm. b Número de crestas por vesícula de las líneas celulares indicadas inducidas (IND) o no inducidas (NON) contadas por separado en sección transversal mitocondrial irregular, alargada y redonda. Las cajas y los bigotes muestran los percentiles 25 a 75 y 5 a 95, respectivamente. El número de secciones transversales analizadas se indica para cada punto de datos. Prueba t de dos colas no apareada, los valores p se muestran en el gráfico. c Capacidad de polarización de la membrana mitocondrial de líneas celulares no inducidas o inducidas por ARNi dos y cuatro DPI medidas con safranina O. Las flechas negra y gris indican la adición de ATP y oligomicina, respectivamente. d Producción de ATP en células permeabilizadas no inducidas (0) o inducidas por ARNi 2 y 4 DPI en presencia de los sustratos e inhibidores indicados. Los gráficos muestran valores individuales de dos réplicas técnicas de n = 2 (subunidad-8), n = 3 (ATPTB4) o n = 4 (subunidad-g) experimentos independientes y medias (barras) y SD (barras de error) de los valores medios de las réplicas técnicas. fosfato de glicerol Gly3P DL; cianuro de potasio KCN; CATR carboxyatractilósido.

A pesar de la ultraestructura mitocondrial alterada, las células de subunidad-gRNAi mostraron solo un fenotipo de crecimiento muy leve, en contraste con todas las demás líneas celulares de RNAi que exhibieron un crecimiento lento constante desde el día tres hasta el cuarto después de la inducción de RNAi (Fig. 7a y Suplementario Fig. 9a ). Esto es consistente con los defectos de crecimiento observados después de la ablación de la subunidad Fo ATPTB119 y las subunidades F1-α y p1812. Por lo tanto, la monomerización de la ATP sintasa tras la ablación de la subunidad g tuvo solo un efecto insignificante en la aptitud de los tripanosomas cultivados en un medio rico en glucosa, en el que la producción de ATP por fosforilación a nivel de sustrato compensa parcialmente la fosforilación oxidativa comprometida37.

La medición de la polarización de la membrana mitocondrial dependiente de ATP sensible a la oligomicina mediante el ensayo de safranina O en células permeabilizadas mostró que la actividad de bombeo de protones de la ATP sintasa en las células de subunidad-gRNAi inducidas se ve afectada de manera insignificante, lo que demuestra que la enzima monomerizada es catalíticamente funcional. Por el contrario, la regulación negativa de ARNi de la subunidad 8, ATPTB4 y ATPTB11, y ATPTB1 resultó en una fuerte disminución de la capacidad de polarización de la membrana mitocondrial, consistente con la pérdida de formas de ATP sintasa tanto monoméricas como diméricas (Fig. 7c). En consecuencia, la eliminación de las mismas subunidades resultó en la incapacidad de producir ATP por fosforilación oxidativa (Fig. 7d). Sin embargo, tras la ablación de la subunidad g, la producción de ATP se vio afectada solo parcialmente, lo que confirma que la ATP sintasa monomerizada permanece catalíticamente activa. La caída de ~50% en la producción de ATP de las células subunidad-gRNAi se puede atribuir a la disminución de la eficiencia de la fosforilación oxidativa debido a la morfología alterada de las crestas. De hecho, cuando las células se cultivaron en ausencia de glucosa, lo que impone la necesidad de fosforilación oxidativa, la eliminación de la subunidad g da como resultado una detención del crecimiento, aunque uno o dos días después de la eliminación de todas las demás subunidades probadas (Fig. 6a). Los datos muestran que la dimerización es crítica cuando la fosforilación oxidativa es la fuente predominante de ATP.

Nuestra estructura del dímero de la ATP sintasa mitocondrial del parásito de los mamíferos T. brucei ofrece una nueva visión del mecanismo de conformación de la membrana, la catálisis rotatoria y la transferencia de protones. Teniendo en cuenta que los tripanosomas pertenecen a un grupo evolutivamente divergente de Kinetoplastida, el dímero ATP sintasa tiene varias características interesantes que difieren de otras estructuras de dímero. La subunidad-b que se encuentra en las ATP sintasas de tipo F bacterianas y mitocondriales parece estar muy reducida a una única hélice transmembrana bH1. El largo bH2, que constituye la parte central del tallo periférico en otros organismos, y también está involucrado en la composición del medio canal de protones luminal, está completamente ausente en T. brucei. Curiosamente, la posición de bH2 en el medio canal de protones está ocupada por una molécula de fosfatidilcolina completamente ordenada que reemplaza un elemento proteico bien conservado en la ruta de los protones. Sin embargo, este reemplazo no es un rasgo común de todas las ATP sintasas de tipo IV, porque la subunidad b en E. gracilis contiene el bH2 canónico pero carece de bH110. Por lo tanto, mientras que la subunidad-b se conserva en Euglenozoa, los linajes de T. brucei y E. gracilis conservaron sus diferentes elementos estructurales que no se superponen (Fig. 2c). La falta de bH2 en T. brucei también afecta la composición del tallo periférico en el que la subunidad d y la subunidad 8 divergentes se unen directamente a una extensión C-terminal de OSCP, lo que indica una arquitectura de tallo periférico remodelada. El tallo periférico entra en contacto con la pieza central de la F1 en varias posiciones, lo que confiere una mayor flexibilidad conformacional a la ATP sintasa.

Usando los datos estructurales y funcionales, también identificamos un elemento estructural conservado de la ATP sintasa que es responsable de su multimerización. En particular, la subunidad g es necesaria para la dimerización, pero prescindible para el ensamblaje de los monómeros F1Fo. Aunque la enzima monomerizada es catalíticamente competente, la incapacidad para formar dímeros da como resultado una estructura de crestas defectuosa y, en consecuencia, conduce a una fosforilación oxidativa comprometida y al cese de la proliferación. Las propiedades de formación de crestas de los dímeros de ATP sintasa mitocondrial son críticas para la producción suficiente de ATP por fosforilación oxidativa, pero no para otras funciones mitocondriales, como lo demuestra la falta de fenotipo de crecimiento de las células subunidad-gRNAi en presencia de glucosa. Por lo tanto, la cepa de agotamiento de la subunidad tripanosoma-g representa una herramienta experimental para evaluar los roles de la función catalítica primaria de la enzima y la actividad de formación de membrana específica de las mitocondrias, destacando la importancia de esta última para la fosforilación oxidativa.

Sobre la base de nuestros datos y estructuras publicadas anteriormente, proponemos un estado ancestral con filas dobles de monómeros de ATP sintasa conectados por módulos e/g longitudinalmente y por otras subunidades Fo transversalmente. Durante el curso de la evolución, diferentes pares de unidades monoméricas de ATP sintasa adyacentes formaron dímeros estables en linajes individuales (Fig. 8). Esto dio lugar a los dímeros de ATP sintasa tipo I y tipo IV altamente divergentes con módulos de subunidad e/g que sirven como motivos de oligomerización o dimerización, respectivamente. Debido a que los tripanosomas pertenecen al supergrupo eucariota de ramificación profunda Discoba, el arreglo propuesto podría haber estado presente en el último ancestro común eucariota. Aunque la similitud de secuencia de la subunidad g es baja y está restringida a la única hélice transmembrana, encontramos homólogos de la subunidad g además de Opisthokonta y Discoba también en Archaeplastida y Amoebozoa, que representan otros supergrupos eucariotas, lo que respalda el papel ancestral en la oligomerización. Figura complementaria 8). En conjunto, nuestro análisis revela que las ATP sintasas mitocondriales que muestran una arquitectura marcadamente divergente comparten el módulo estructural ancestral que promueve la oligomerización.

Modelo esquemático de la evolución de las ATP sintasas tipo I y IV. Las ATP sintasas mitocondriales se derivan de un complejo monomérico de origen proteobacteriano. En un ancestro mitocondrial, la adquisición de subunidades específicas de mitocondrias, incluido el módulo de subunidad-e/g, dio como resultado el ensamblaje de filas dobles de ATP sintasa, la base estructural para la biogénesis de las crestas. A través de la divergencia, evolucionaron diferentes arquitecturas de ATP sintasa, con el módulo de subunidad-e/g funcionando como un motivo de oligomerización (tipo I) o dimerización (tipo IV), lo que resultó en ensamblajes de fila distintos entre linajes mitocondriales.

Se cultivaron cepas procíclicas de T. brucei en medio SDM-79 suplementado con suero bovino fetal al 10% (v/v). Para las curvas de crecimiento en condiciones sin glucosa, las células se cultivaron en medio SDM-80 con FBS dializado al 10%. Las líneas celulares de ARNi se cultivaron en presencia de 2,5 μg/ml de fleomicina y 1 μg/ml de puromicina. Para la purificación de ATP sintasa, las mitocondrias se aislaron de la cepa 427 de Lister. Por lo general, se recogieron 1,5 × 1011 células, se lavaron en tampón de fosfato de sodio 20 mM pH 7,9 con NaCl 150 mM y glucosa 20 mM, se resuspendieron en tampón hipotónico Tris-HCl 1 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, y disgregado por 10 golpes en un homogeneizador Dounce de 40 ml. La lisis se detuvo mediante la adición inmediata de sacarosa a 0,25 M. Las mitocondrias crudas se sedimentaron (15 min a 16 000 × g, 4 °C), se resuspendieron en Tris-HCl 20 mM pH 8,0, sacarosa 250 mM, MgCl2 5 mM, 0,3 mM CaCl2 y se trató con 5 μg/ml de ADNasa I. Después de 60 min en hielo, se añadió un volumen de tampón STE (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM sacarosa, 2 mM EDTA) y se sedimentaron las mitocondrias (15 min a 16000 × g, 4 °C). El sedimento se resuspendió en Percoll al 60 % (v/v) en STE y se cargó en seis gradientes lineales de Percoll al 10–35 % en STE en tubos de policarbonato para rotor SW28 (Beckman). Los gradientes se centrifugaron durante 1 h a 104000 × g, 4 °C. Se recolectó la fase intermedia que contenía vesículas mitocondriales (15-20 ml por tubo), se lavó cuatro veces en el tampón STE y los sedimentos se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.

Para regular a la baja las subunidades de ATP sintasa por ARNi, los fragmentos de ADN correspondientes a las secuencias objetivo individuales se amplificaron mediante PCR a partir de ADN genómico de la cepa Lister 427 utilizando cebadores directos e inversos extendidos con sitios de restricción XhoI y KpnI y XbaI y BamHI, respectivamente (Tabla complementaria 3). Cada fragmento se insertó en los múltiples sitios de clonación 1 y 2 del vector pAZ0055, derivado de pRPHYG-iSL (cortesía de Sam Alsford) mediante la sustitución del gen de resistencia a la higromicina por el gen de resistencia a la fleomicina, con las enzimas de restricción KpnI/BamHI y XhoI/XbaI, respectivamente. . Las construcciones resultantes con casetes de ARNi impulsados por la polimerasa T7 inducible por tetraciclina se linealizaron con NotI y se transfectaron en una línea celular derivada de la cepa Lister 427 mediante la integración de la construcción SmOx para la expresión de la polimerasa T7 y el represor de tetraciclina38 en el locus de β-tubulina. Se indujo ARNi en poblaciones semiclonales seleccionadas mediante la adición de 1 μg/ml de tetraciclina y se verificó la regulación a la baja de los ARNm diana mediante RT-PCR cuantitativa 2 y 4 días después de la inducción. El ARN total aislado con un kit RNeasy Mini (Qiagen) se trató con 2 μg de DNasa I y luego se transcribió inversamente a ADNc con el kit TaqMan Reverse Transcription (Applied Biosciences). Las reacciones de qPCR se configuraron con Light Cycler 480 SYBR Green I Master mix (Roche), 2 μl de ADNc y cebadores 0,3 μM (Tabla complementaria 3) y se ejecutaron en LightCycler 480 (Roche). La expresión relativa de los genes diana se calculó utilizando el método - ΔΔCt con 18S rRNA o β-tubulina como genes de referencia endógenos y se normalizó a células no inducidas.

Se prepararon lisados de células completas para la electroforesis de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio desnaturalizante (SDS-PAGE) a partir de células resuspendidas en tampón PBS (tampón fosfato 10 mM, NaCl 130 mM, pH 7,3) mediante la adición de tampón Laemmli 3x (Tris 150 mM pH 6,8, 1,4-ditiotreitol 300 mM, SDS al 6 % (p/v), glicerol al 30 % (p/v), azul de bromofenol al 0,02 % (p/v) hasta la concentración final de 1 × 107 células en 30 μl. Los lisados se hirvieron a 97 °C durante 10 min y se almacenaron a -20 °C. Para la inmunotransferencia, los lisados de 3 × 106 células se separaron en geles de poliacrilamida Tris-glicina con un gradiente de 4 a 20 % (BioRad 4568094), se sometieron a electrotransferencia en una membrana de PVDF (Pierce 88518) y se probaron con los anticuerpos respectivos (Tabla complementaria 4). Las membranas se incubaron con el sustrato Clarity Western ECL (BioRad 1705060EM) y se detectó la quimioluminiscencia en un instrumento ChemiDoc (BioRad). Las intensidades de las bandas se cuantificaron densitométricamente utilizando el software ImageLab. Los niveles de subunidades individuales se normalizaron a la señal de mtHsp70.

La PAGE nativa azul (BN-PAGE) se realizó como se describió anteriormente12 con las siguientes modificaciones. Se resuspendieron vesículas mitocondriales brutas de 2,5 × 108 células en 40 µl de tampón de solubilización A (ácido ε-aminocaproico (ACA) 2 mM, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM, Bis-Tris/HCl 50 mM, pH 7,0) y se solubilizaron con Dodecilmaltósido (β-DDM) al 2% (p/v) durante 1 h en hielo. Los lisados se aclararon a 16,000 × g durante 30 min a 4 ° C y su concentración de proteína se estimó mediante el ensayo de ácido bicinconínico. Para cada punto de tiempo, se mezcló un volumen de lisado mitocondrial correspondiente a 4 μg de proteína total con 1,5 μl de colorante de carga (500 mM ACA, 5 % (p/v) Coomassie Brilliant Blue G-250) y 5 % (p/ v) glicerol y con ACA 1 M hasta un volumen final de 20 μl/pocillo y resuelto en gel nativo PAGE 3–12% Bis-Tris (Invitrogen). Después de la electroforesis (3 h, 140 V, 4 °C), las proteínas se transfirieron mediante electrotransferencia a una membrana de PVDF (2 h, 100 V, 4 °C, agitación), seguido de inmunodetección con un anticuerpo apropiado (Tabla complementaria 4) .

La capacidad de polarizar la membrana mitocondrial se determinó fluorométricamente empleando colorante safranina O (Sigma S2255) en células permeabilizadas. Para cada muestra, se recogieron 2 × 107 células y se lavaron con tampón ANT (KCl 8 mM, K-gluconato 110 mM, NaCl 10 mM, Hepes de ácido libre 10 mM, K2HPO4 10 mM, sal de potasio EGTA 0,015 mM, manitol 10 mM , 0,5 mg/ml de BSA sin ácidos grasos, MgCl2 1,5 mM, pH 7,25). Las células se permeabilizaron con digitonina 8 μM en 2 ml de tampón ANT que contenía safranina O 5 μM. La fluorescencia se registró durante 700 s en un espectrofluorímetro Hitachi F-7100 (Hitachi High Technologies) a una velocidad de adquisición de 5 Hz, utilizando 495 y 585 nm. longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente. Se añadieron ATP 1 mM (PanReac AppliChem A1348,0025) y oligomicina 10 μg/ml (Sigma O4876) después de 230 s y 500 s, respectivamente. La adición final del desacoplador SF 6847 (250 nM; Enzo Life Sciences BML-EI215-0050) sirvió como control para la despolarización máxima. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente y agitación constante.

La producción de ATP en mitocondrias aisladas con digitonina se realizó como se describió anteriormente39. Brevemente, se lisaron 1 × 108 células por punto de tiempo en tampón SoTE (sorbitol 600 mM, EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7,75) que contenía digitonina al 0,015 % (p/v) durante 5 min en hielo. Después de la centrifugación (3 min, 4000 × g, 4 °C), la fracción citosólica soluble se descartó y el sedimento organelar se resuspendió en 75 μl de tampón de ensayo de producción de ATP (sorbitol 600 mM, MgSO4 10 mM, tampón de fosfato de potasio 15 mM pH 7,4, Tris-HCl 20 mM pH 7,4, 2,5 mg/ml de BSA libre de ácidos grasos). La producción de ATP se indujo mediante la adición de fosfato de DL-glicerol 20 mM (sal de sodio) y ADP 67 μM. Las muestras de control se preincubaron con los inhibidores cianuro de potasio (1 mM) y carboxyatractilósido (6,5 μM) durante 10 min a temperatura ambiente. Después de 30 min a temperatura ambiente, la reacción se detuvo mediante la adición de 1,5 μl de ácido perclórico al 70 %. La concentración de ATP se estimó utilizando el Roche ATP Bioluminescence Assay Kit HS II en un lector de placas Tecan Spark. Los valores de luminiscencia de las muestras inducidas por ARNi se normalizaron con los de la muestra no inducida correspondiente.

Las muestras se centrifugaron y el sedimento se transfirió a los portamuestras que se completaron con BSA al 20 % y se congelaron inmediatamente utilizando un congelador de alta presión Leica EM ICE (Leica Microsystems). La sustitución por congelación se realizó en presencia de tetróxido de osmio al 2 % diluido en acetona al 100 % a -90 °C. Después de 96 h, las muestras se calentaron a -20 °C con una pendiente de 5 °C/h. Después de las siguientes 24 h, la temperatura se aumentó a 3 °C (3 °C/h). A temperatura ambiente, las muestras se lavaron en acetona y se infiltraron con una mezcla de acetona/resina EMbed 812 (EMS) al 25, 50, 75 % durante 1 h en cada paso. Finalmente, las muestras se infiltraron en resina 100% y se polimerizaron a 60 °C durante 48 h. Se cortaron secciones ultrafinas (70 nm) con un cuchillo de diamante, se colocaron en rejillas de cobre y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las micrografías de TEM se tomaron con una cámara Mega View III (SIS) utilizando un TEM JEOL 1010 que funciona a un voltaje de aceleración de 80 kV.

Las mitocondrias de 3 × 1011 células se lisaron con β-DDM al 1 % (p/v) en 60 ml de Bis-tris propano 20 mM pH 8,0 con glicerol al 10 % e inhibidores de proteasa completos sin EDTA (Roche) durante 20 min a 4 ºC El lisado se aclaró mediante centrifugación a 30.000 × g durante 20 min a 4 °C y se ajustó a pH 6,8 mediante la adición gota a gota de ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico 1 M pH 5,9. TbIF1 recombinante sin región de dimerización, cuya afinidad por la F1-ATPasa se incrementó mediante el truncamiento N-terminal y la sustitución de la tirosina 36 por triptófano20, con una etiqueta de glutatión S-transferasa (GST) C-terminal (TbIF1(9-64)-Y36W- GST) se añadió en un exceso molar de aproximadamente 10 veces sobre el contenido estimado de ATP sintasa. La unión de TbIF1 se facilitó mediante la adición de ATP 2 mM neutralizado con sulfato de magnesio 4 mM. Después de 5 min, se añadió cloruro de sodio a 100 mM, el lisado se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm y se cargó inmediatamente en una columna GSTrap HP de 5 ml (Cytiva) equilibrada en tampón de unión Bis-Tris-Propano 20 mM pH 6,8 que contenía 0,1 % (p/v) glicodiosgenina (GDN; Avanti Polar Lipids), glicerol al 10 % (v/v), cloruro de sodio 100 mM, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 1 mM, ATP 1 mM, magnesio 2 mM sulfato, 15 μg/ml cardiolipina, 50 μg/ml 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 25 μg/ml 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE) y 10 μg/ml de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)] (POPG). Todos los fosfolípidos se adquirieron de Avanti Polar Lipids (números de catálogo 840012C, 850457C, 850757C y 840757, respectivamente). La ATP sintasa se eluyó con un gradiente de glutatión reducido 20 mM en tampón Tris pH 8,0 que contenía los mismos componentes que el tampón de unión. Las fracciones que contenían ATP sintasa se combinaron y concentraron hasta 150 µl en un concentrador centrífugo Vivaspin con un límite de peso molecular de 30 kDa. La muestra se fraccionó mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superose 6 Increment 3,2/300 GL (Cytiva) equilibrada en un tampón que contenía Tris 20 mM pH 8,0, cloruro de sodio 100 mM, cloruro de magnesio 2 mM, GDN al 0,1 % (p/v) , cardiolipina 3,75 μg/ml, POPC 12,5 μg/ml, POPE 6,25 μg/ml y POPG 2,5 μg/ml a 0,03 ml/min. Las fracciones correspondientes a la ATP sintasa se agruparon, se complementaron con β-DDM al 0,05 % (p/v) que nosotros y otros encontraron experimentalmente para conservar mejor los ensamblajes de dímeros en crio-EM40, y se concentraron hasta 50 μl.

Las muestras se vitrificaron en rejillas de malla 300 Quantifoil R1.2/1.3 Au con descarga luminiscente después de la transferencia durante 3 s, seguido de inmersión en etano líquido usando un Vitrobot Mark IV. Se recolectaron 5199 películas usando EPU 1.9 en un Titan Krios (ThermoFisher Scientific) operado a 300 kV con un aumento nominal de 165 kx (0.83 Å/pixel) con una cámara Quantum K2 (Gatan) usando un ancho de rendija de 20 eV. Los datos se recopilaron con una tasa de exposición de 3,6 electrones/px/s, una exposición total de 33 electrones/Å2 y 20 fotogramas por película.

El procesamiento de imágenes se realizó dentro del marco Scipion 241, utilizando RELION-3.0 a menos que se especifique lo contrario. Las películas se corrigieron en movimiento utilizando la implementación RELION de MotionCor2. Inicialmente, se seleccionaron 294 054 partículas utilizando la selección basada en referencias en Gautotch (http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch) y los parámetros de la función de transferencia de contraste usaban GCTF42. El procesamiento de imágenes posterior se realizó en RELION-3.0 y se utilizó la clasificación 2D y 3D para seleccionar 100 605 partículas, que luego se extrajeron en una caja de 560 píxeles sin clasificar (Fig. S1). Se obtuvo un modelo inicial del dímero de ATP sintasa utilizando la generación de modelos 3D de novo. Utilizando el refinamiento enmascarado con simetría C2 aplicada, se obtuvo una estructura de 2,7 Å de la región de la membrana después del refinamiento CTF por partícula y el pulido bayesiano. Después de la expansión de la simetría C2 y la sustracción de la señal de un monómero, se obtuvo un mapa de 3,7 Å del tallo periférico. Mediante la clasificación 3D (T = 100) de partículas alineadas, con una máscara en la región del anillo F1/c, se separaron 10 subestados rotacionales diferentes y se obtuvieron mapas con una resolución de 3,5 a 4,3 Å mediante refinamiento 3D. Los autores señalan que la cantidad de clases identificadas en este estudio probablemente refleja la cantidad limitada de partículas, en lugar del espacio conformacional completo del complejo. Al combinar partículas de todos los estados pertenecientes al estado de rotación principal 1, se obtuvieron un mapa de 3,7 Å del rotor y un mapa de consenso de 3,2 Å del dímero de ATP sintasa completo con ambos rotores en el estado de rotación principal 1.

Se construyó automáticamente un modelo atómico inicial de la región de la membrana Fo estática utilizando Bucaneer43. Posteriormente, las subunidades se asignaron directamente desde el mapa crio-EM, 15 de ellas correspondientes a las subunidades de ATP sintasa de T. brucei previamente identificadas21, mientras que tres subunidades (ATPTB14, ATPEG3 y ATPEG4) se identificaron aquí mediante búsquedas BLAST. La construcción del modelo manual se realizó en Coot 0.9.544 utilizando T. brucei F1 PDB 6F5D [https://www.rcsb.org/structure/6F5D] (T. brucei F1)13 y modelos de homología45 de E. gracilis OSCP y c-ring PDB 6TDU [https://www.rcsb.org/structure/6TDU] (ATP sintasa mitocondrial de E. gracilis)10 como modelos iniciales. Los ligandos se ajustaron manualmente al mapa y las restricciones fueron generadas por el servidor GRADE (http://grade.globalphasing.org). Las cardiolipinas se asignaron en base a la presencia de una densidad alargada característica ramificada en ambos extremos, correspondiente a dos grupos fosfatidilo unidos por el puente central de glicerol. Los lípidos monofosfatidilo se asignaron en función de las densidades de sus grupos principales. Las formas tetraédricas características de las densidades de los grupos de colina sirvieron para distinguir las fosfatidilcolinas de los grupos de cabeza de fosfatidiletanolamina alargados (Figura complementaria 5g, h). El refinamiento del espacio real se realizó en PHENIX 1.17.1 utilizando mapas autoafilados y filtrados con resolución local de la región de la membrana, la punta del tallo periférico, el anillo c/tallo central y los monómeros F1Fo en diferentes estados de rotación, respectivamente, usando restricciones de la estructura. Las estadísticas del modelo se generaron utilizando MolProbity46 y EMRinger47. Finalmente, los modelos refinados respectivos se combinaron en un modelo de dímero de ATP sintasa compuesto y se refinaron en espacio real contra el mapa de dímero de ATP sintasa de consenso filtrado por resolución local con ambos monómeros en estado rotacional 1, aplicando referencia restricciones Las figuras de las estructuras se prepararon usando ChimeraX 0.9148, los medios canales de protones se rastrearon usando HOLLOW49.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas generadas en este estudio han sido depositadas en el Protein Data Bank (PDB) bajo los códigos de acceso: 8AP7 (membrana-región), 8AP8 (tallo periférico), 8AP9 (rotor), 8AP6 (F1Fo dimer), 8APA (rotacional 1a), 8APB (estado de rotación 1b), 8APC (estado de rotación 1c), 8APD (estado de rotación 1d), 8APE (estado de rotación 1e), 8APF (estado de rotación 2a), 8APG (estado de rotación 2b), 8APH (estado de rotación 2c), 8APJ (estado de rotación 2d), 8APK (estado de rotación 3). Los mapas crio-EM filtrados con resolución local, semimapas, máscaras y curvas FSC se han depositado en el banco de datos de microscopía electrónica con los códigos de acceso: EMD-15560 (región de membrana), EMD-15561 (tallo periférico), EMD-15562 (rotor), EMD-15559 (dímero F1Fo), EMD-15563 (estado de rotación 1a), EMD-15564 (estado de rotación 1b), EMD-15565 (estado de rotación 1c), EMD-15566 (estado de rotación 1d), EMD- 15567 (estado de rotación 1e), EMD-15568 (estado de rotación 2a), EMD-15570 (estado de rotación 2b), EMD-15571 (estado de rotación 2c), EMD-15572 (estado de rotación 2d), EMD-15573 (estado de rotación 3 ). Las micrografías TEM de secciones de células delgadas están disponibles a los autores previa solicitud. Todos los demás datos están disponibles en el artículo, la información complementaria o el archivo de datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Las coordenadas atómicas que se utilizaron en este estudio: 6TDU (ATP sintasa mitocondrial de E. gracilis), 6TDV (ATP sintasa mitocondrial de E. gracilis, región de membrana), 6B2Z (ATP sintasa mitocondrial de S. cerevisiae), 6F5D (T. brucei F1) , 6ZNA (ATP sintasa mitocondrial de S. scrofa) Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a John E. Walker y Martin G. Montgomery por su valiosa ayuda con la purificación de la ATP sintasa en la etapa inicial del proyecto. Reconocemos la instalación central de tomografía y microscopía electrónica criogénica de CIISB, Centro Instruct-CZ, respaldada por MEYS CR (LM2018127). Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Fundación Checa para la Ciencia número 18-17529S a AZ y 20-04150Y a OG y por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y el proyecto CZ.02.1.01/0.0 del Ministerio de Educación, Juventud y Deporte (MEYS). /0.0/16_019/0000759 a AZ, Fundación Sueca para la Investigación Estratégica (FFL15:0325), Fundación Ragnar Söderberg (M44/16), Consejo Europeo de Investigación (ERC-2018-StG-805230), Fundación Knut y Alice Wallenberg (2018.0080) , y el Programa de Jóvenes Investigadores de EMBO para AA

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Estocolmo.

Estos autores contribuyeron igualmente: Ondřej Gahura, Alexander Mühleip.

Instituto de Parasitología, Centro de Biología, Academia Checa de Ciencias, 37005, České Budějovice, República Checa

Ondřej Gahura, Carolina Hierro-Yap, Brian Panicucci, Minal Jain, Martina Slapničková & Alena Zíková

Laboratorio Science for Life, Departamento de Bioquímica y Biofísica, Universidad de Estocolmo, 17165, Solna, Suecia

Alexander Mühleip y Alexey Amunts

Facultad de Ciencias, Universidad de Bohemia del Sur, 37005, České Budějovice, República Checa

Carolina Hierro-Yap, Minal Jain, David Hollaus & Alena Zíková

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AZ y AA concibieron y diseñaron la obra. OG preparó la muestra para crio-EM. OG y AM realizaron la selección inicial. AM procesó los datos crio-EM y construyó el modelo. OG, AM y AA analizaron la estructura. BP, CHY, MJ, MS, OG, DH y AZ realizaron análisis bioquímicos. OG, AM, AA y AZ interpretaron los datos. OG, AM, AA y AZ escribieron y revisaron el manuscrito. Todos los autores contribuyeron al análisis y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Alena Zíková o Alexey Amunts.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Gahura, O., Mühleip, A., Hierro-Yap, C. et al. Un módulo de interacción ancestral promueve la oligomerización en ATP sintasas mitocondriales divergentes. Nat Comun 13, 5989 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33588-z

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Recibido: 22 diciembre 2021

Aceptado: 22 de septiembre de 2022

Publicado: 11 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33588-z

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