Vía excitatoria monosináptica del tronco encefálico que impulsa las actividades locomotoras y las respuestas cardiovasculares simpáticas

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 5079 (2022) Citar este artículo

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El ejercicio, incluida la locomoción, requiere ajustes cardiovasculares autonómicos apropiados para satisfacer las demandas metabólicas de los músculos que se contraen, pero aún se desconoce la arquitectura funcional del cerebro que subyace a estos ajustes. Aquí, demostramos los circuitos del tronco encefálico que desempeñan un papel esencial en la transmisión de señales motoras voluntarias, es decir, el comando central, para impulsar las actividades locomotoras y las respuestas cardiovasculares simpáticas. Las neuronas locomotoras mesencefálicas en ratas transmiten señales excitatorias impulsadas por comandos centrales a la médula ventrolateral rostral al menos parcialmente a través de procesos glutamatérgicos, para activar los sistemas nerviosos somatomotor y simpático. La excitación optogenética de esta vía monosináptica provoca respuestas locomotoras y cardiovasculares como se observa durante el ejercicio de carrera, mientras que la inhibición de la vía suprime las actividades locomotoras y la elevación de la presión arterial durante la carrera voluntaria sin afectar la homeostasis cardiovascular basal. Estos resultados demuestran una vía subcortical importante que transmite señales de comando central, lo que brinda una visión clave del mecanismo del circuito central requerido para el acondicionamiento fisiológico esencial para maximizar el rendimiento del ejercicio.

El ejercicio, incluida la locomoción, que forma parte del comportamiento fundamental de los vertebrados, incluidos los humanos, se acompaña de ajustes cardiovasculares autonómicos que proporcionan los recursos metabólicos, como el combustible y el oxígeno, que exige la contracción de los músculos esqueléticos y, por lo tanto, aumentan el rendimiento físico. La contribución de una señal motora descendente realimentada desde el prosencéfalo al control cardiovascular se ha sugerido durante más de un siglo1,2. Actualmente, esta señal de realimentación se ha denominado comando central y se postula como activación paralela de los sistemas motores somáticos y autónomos en el cerebro para aumentar simultáneamente la actividad muscular junto con la presión arterial y la contractilidad cardíaca3. Este concepto surgió por primera vez de un estudio en humanos que mostró que la magnitud de las respuestas cardiovasculares durante el ejercicio isométrico voluntario a una tensión muscular constante se correlacionó positivamente con la cantidad de activación del comando central que cambió por las contracciones reflejas debido a la vibración del tendón en el músculo agonista o antagonista4. El comando central está acoplado a la activación del sistema nervioso simpático independientemente de la retroalimentación del movimiento, como lo muestran los aumentos en las variables cardiovasculares durante la locomoción ficticia en gatos decorticados y paralizados5 y las respuestas cardiovasculares exageradas a la contracción muscular voluntaria en sujetos humanos después de la parálisis6,7.

La ubicación precisa de la fuente del comando central sigue sin estar clara porque el mecanismo del circuito central mediante el cual las señales del comando central provocan ajustes cardiovasculares autonómicos durante el ejercicio aún no se ha dilucidado por completo. Las regiones cerebrales autonómicas activadas en respuesta al ejercicio voluntario8,9,10,11,12 o regiones cuya estimulación provoca respuestas autonómicas o somatomotoras13,14,15,16,17,18 pueden estar involucradas en el control de comando central de la circulación. Por ejemplo, los estudios en humanos que utilizan técnicas neuroquirúrgicas sugirieron que los circuitos mesencefálicos, incluidos el núcleo subtalámico (STN) y la sustancia gris periacueductal (PAG), cuyas actividades neuronales se elevan durante el ejercicio volitivo11, configuran circuitos subcorticales para transmitir señales de comando central19 como lo demuestra el efecto presor de estimulación eléctrica del STN17 o PAG18 dorsal/lateral en pacientes despiertos con enfermedad de Parkinson o dolor crónico. No obstante, no se han demostrado los roles causales de estas regiones cerebrales en los cambios autonómicos durante el ejercicio, así como las conexiones funcionales con otras regiones. El sustrato cerebral del comando central también ha ganado importancia clínica. La regulación cardiovascular anormal durante el ejercicio en condiciones patológicas, como la insuficiencia cardíaca, aumenta la intolerancia al ejercicio y el riesgo de eventos cardíacos fatales como la arritmia20. Esto se debe, al menos en parte, a una disfunción del comando central21,22, mientras que los programas de ejercicio terapéutico para los pacientes mejoran su estado funcional y sus resultados23.

El bulbo raquídeo ventrolateral rostral (RVLM), que se encuentra inmediatamente caudal al polo caudal del núcleo facial, contiene neuronas premotoras simpáticas que se proyectan espinalmente, más de la mitad de las cuales son neuronas adrenérgicas C124. Tanto las neuronas RVLM C1 como las no C1 se excitan con el ejercicio voluntario8,9,12 y desempeñan un papel fundamental en la regulación del tono vasomotor simpático25,26,27,28. Por lo tanto, el RVLM es probablemente un nodo clave del mecanismo del circuito central para las respuestas cardiovasculares simpáticas durante el ejercicio29. En el presente estudio, para identificar una vía monosináptica subcortical que transmita señales de comando centrales al RVLM durante el ejercicio voluntario para provocar respuestas cardiovasculares, realizamos experimentos fisiológicos in vivo y de neuroanatomía funcional en ratas para registrar las descargas de los nervios periféricos, los cambios cardiovasculares y los comportamientos en combinación con técnicas optogenéticas para manipular una vía de interés.

Primero buscamos neuronas que proyecten RVLM en ratas a través de un rastreo retrógrado con el trazador, la subunidad b de la toxina del cólera (CTb), inyectado unilateralmente en el RVLM (Fig. 1a, b). Se encontró que un número significativo de cuerpos celulares neuronales marcados con CTb estaban distribuidos bilateralmente en áreas del mesencéfalo, incluido el núcleo cuneiforme (CnF) y el núcleo tegmental pedunculopontino (PPTg), el último de los cuales albergaba muchas neuronas colinérgicas (Fig. 1c). Estos dos núcleos constituyen un área funcional conocida como región locomotora mesencefálica (MLR), que es capaz de iniciar y controlar la locomoción y está bien conservada evolutivamente en todas las especies de mamíferos, incluidos los humanos30,31. Por lo tanto, nos enfocamos en esta vía monosináptica MLR → RVLM como candidata para la ruta subcortical que media la señalización de comando central comprometida para el ejercicio locomotor. El MLR contiene neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas, además de las neuronas colinérgicas PPTg, que bilateralmente envían numerosas proyecciones a lo largo de la formación reticular medular32. Sin embargo, muy pocas neuronas PPTg marcadas con CTb fueron inmunorreactivas para la colina acetiltransferasa (ChAT) (0.6 ± 0.3%, n = 3) (Fig. 1d). Por lo tanto, las neuronas MLR que proyectan RVLM son principalmente no colinérgicas.

a, b Inyección de CTb en el RVLM unilateralmente. TH tirosina hidroxilasa; IO núcleo oliva inferior; núcleo paragigantocelular lateral del LPGi; NA núcleo anbiguus. Barra de escala: 1 mm. c Dibujo de la distribución de células marcadas con CTb [combinadas de 8 ratas (6 machos, 2 hembras)] y células inmunorreactivas a ChAT positivas o negativas para CTb [combinadas de 3 de 8 ratas (2 machos y 1 hembra)] en la sección coronal del mesencéfalo. acueducto de Aq; Gris periacueductal PAG. d Imagen confocal que muestra que las células PPTg marcadas con CTb no se fusionaron con las células inmunorreactivas a ChAT. Barra de escala: 50 μm. e, f Inyecciones de AAV-CMV-ChIEF-tdTomato en el MLR bilateralmente. Barras de escala: 1 mm (mesencéfalo) y 200 μm (ampliada). g tdAxones etiquetados con tomate distribuidos en la médula ventral. Barra de escala: 1 mm. h Imagen confocal que muestra asociaciones cercanas de hinchazones axonales marcadas con tdTomato que contienen VGLUT2 (puntas de flecha) con dendrita neuronal RVLM C1 y cuerpo celular (asterisco). Barra de escala: 10 μm. i Esquema experimental para estudiar las inmunorreactividades de Fos en neuronas MLR que proyectan RVLM de ratas con y sin ejercicio en cinta rodante. j Tinción de inmunofluorescencia de GFP y Fos. Las puntas de flecha indican la expresión de Fos en células marcadas con GFP que se encuentran en el PPTg. Barras de escala: 100 μm. k Comparaciones de células inmunorreactivas a Fos en neuronas MLR que proyectan RVLM marcadas con GFP entre controles no ejercitados y ratas ejercitadas (n = 7 para cada grupo distinto; todos machos). Los datos se analizaron mediante la prueba t de Welch bilateral; la información estadística, incluidos los valores estadísticos t y los grados de libertad, se presenta en la Tabla complementaria 15. Los datos que se muestran son medias ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Las imágenes de la sección del cerebro utilizadas en las figuras (a, e, i) se adaptaron de "Paxinos G & Watson C. The rat brain in stereotaxic coordenadas. 6th edn. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)".

Para rastrear anterógradamente la vía MLR → RVLM, realizamos inyecciones bilaterales en la región a través de CnF y PPTg con un vector de virus adenoasociado (AAV) que codifica ChIEF, una variante de canalrodopsina, fusionada con tdTomato (Fig. 1e, f). Los axones derivados de MLR marcados con ChIEF-tdTomato se distribuyeron abundantemente en la parte ventral de la médula (Fig. 1g); además, las inflamaciones axonales derivadas de MLR que contenían el transportador vesicular de glutamato 2 (VGLUT2) estaban estrechamente asociadas con los cuerpos celulares y las dendritas de las neuronas RVLM C1 (Fig. 1h), lo que sugiere que existe un contacto sináptico entre las neuronas glutamatérgicas MLR → RVLM y las neuronas RVLM C1 . En general, estas observaciones indican que el RVLM recibe proyecciones glutamatérgicas monosinápticas bilaterales del MLR.

Luego cuestionamos si la vía MLR → RVLM se activa al correr ejercicio. Investigamos la expresión de Fos, un correlato bioquímico del aumento de la activación, en neuronas de proyección MLR → RVLM después de correr voluntariamente en ratas que habían recibido inyecciones bilaterales de RVLM de un AAV retrógrado (AAVrg) que codifica EGFP; estas ratas habían sido entrenadas para acostumbrarse al ejercicio voluntario en cinta rodante (Fig. 1i). De acuerdo con las observaciones de ratas inyectadas con CTb, la transducción de AAVrg de las neuronas que proyectan RVLM dio como resultado la localización densa de cuerpos celulares no colinérgicos marcados con EGFP en el MLR a través del CnF y PPTg (Suplementario Fig. 1a, b). La carrera voluntaria en la cinta rodante (16 m / min durante 40 min) aumentó la expresión de Fos en las neuronas MLR marcadas con EGFP (es decir, que proyectan RVLM), en comparación con el control sin ejercicio (Fig. 1j, k). Estos resultados indican que el ejercicio de carrera voluntaria activa la vía MLR → RVLM, de acuerdo con la noción de que esta vía monosináptica es parte del mecanismo del circuito central que media la señalización de comando central volitiva involucrada para el ejercicio de carrera.

También se observó un aumento de la expresión de Fos después del ejercicio en cinta rodante en las neuronas PPTg inmunorreactivas para ChAT (Fig. 1c, d complementarias). Las neuronas colinérgicas PPTg excitadas pueden desempeñar un papel en la aceleración, pero no en la provocación, de la locomoción durante el ejercicio de carrera33.

Para estudiar el papel de las neuronas MLR → RVLM en la regulación cardiovascular autonómica, examinamos el efecto de la estimulación optogenética de las neuronas MLR → RVLM sobre la presión arterial (AP) y la frecuencia cardíaca (FC). En ratas anestesiadas con uretano, en las que las neuronas MLR expresaron ChIEF-tdTomato o palGFP (control) a través de inyecciones de AAV en el MLR (Fig. 1e-h), el RVLM se iluminó bilateralmente usando luz láser azul pulsada de 5 ms (473 nm de longitud de onda) con una salida de 10 mW (cuando se activa continuamente) para fotoestimular los axones neuronales MLR → RVLM a través de fibras ópticas insertadas en el cerebro (Fig. 2a complementaria). Una serie de pulsos a 20 o 40 Hz durante 2 min provocó constantemente respuestas taquicardiacas y presoras en ratas que expresaban ChIEF-tdTomato pero no en controles que expresaban palGFP (Fig. 2b, c complementarias). Estas observaciones indican que las neuronas MLR → RVLM excitadas provocan respuestas cardiovasculares autonómicas, lo que nos llevó a examinar directamente el papel simpatoexcitatorio de la vía monosináptica MLR → RVLM con el registro electrofisiológico de la actividad del nervio simpático renal (RSNA).

En ratas anestesiadas, en las que las neuronas que proyectan RVLM expresaron canalrodopsina-2 (ChR2) etiquetadas con GFP o EGFP de control a través de inyecciones bilaterales de AAVrg en el RVLM (Figura complementaria 1a, b), el MLR se iluminó bilateralmente para fotoestimular los cuerpos celulares /dendritas de neuronas MLR → RVLM (dirección de somas) de manera intermitente, es decir, a través de una serie de pulsos de 0,5 s (luz láser azul pulsada de 5 ms a 10, 20 o 40 Hz, salida de láser de 10 mW) con un intervalo de 1,5 s durante 1 min; luego se examinaron los efectos de este procedimiento en RSNA (Fig. 2a). La fotoestimulación provocó una simpatoexcitación renal (RSNA) que fue sincrónica con cada serie de pulsos de iluminación de 0,5 s y estuvo acompañada por un aumento en AP pero no en HR durante el período de estimulación de 1 min (Fig. 2b). Los análisis de superposición y promediación de los cambios de RSNA durante 30 episodios de intervenciones (Fig. 2c) mostraron que la serie de pulsos a 10 o 20 Hz, pero no a 40 Hz, provocó significativamente una simpatoexcitación renal, seguida de una rápida inhibición simpática y un retorno a los niveles previos a la fotoestimulación. (Figura 2d). El componente simpatoexcitatorio en respuesta a la fotoestimulación a 40 Hz, evaluado por el área bajo la curva (AUC) para los cambios en RSNA (Fig. 2c), fue un 29 % más pequeño que el de 20 Hz (P = 0,034, dos caras). prueba t pareada), quizás debido a los efectos anestésicos ya que la fotoestimulación a 40 Hz en ratas descerebradas no anestesiadas aumentó significativamente la RSNA a 20 Hz (descrito más adelante; Fig. 3). La anestesia con uretano podría amplificar el efecto de la inhibición recurrente reclutada por la fotoestimulación de alta frecuencia dentro del circuito simpático-regulador. Indicando la especificidad de las respuestas simpatoexcitatorias / simpatoinhibitorias provocadas por la estimulación optogenética de las neuronas MLR → RVLM, no se provocó ningún cambio de RSNA mediante la iluminación de las neuronas MLR que expresan EGFP y proyectan RVLM en ratas de control (Fig. 3a complementaria).

a Estimulación optogenética de neuronas MLR → RVLM en ratas anestesiadas. Flechas: ubicación de las puntas de fibra óptica. b Grabación representativa durante la estimulación optogenética (20 Hz) en una rata anestesiada que expresa ChR2-GFP. Los fondos de color azul aguamarina indican períodos de iluminación. c Análisis de superposición y promedio realizado en RSNA que se muestra en el panel b. Los cursos de tiempo (contenedores de 10 ms) de cambios porcentuales en RSNA desde la línea de base (= valor promedio de 30 s antes de la primera intervención optogenética) durante cada ciclo (superior) se promediaron en cada punto de tiempo durante 30 intervenciones (inferior). d Cursos de tiempo (contenedores de 100 ms) de ∆RSNA, después de superponer y promediar el análisis, en respuesta a la estimulación neuronal intermitente MLR → RVLM en ratas anestesiadas que expresan ChR2-GFP [n = 9 (7 machos, 2 hembras) además de n = 7 (5 machos, 2 hembras) a 10 Hz]. e Efecto de los bloqueos de los receptores de glutamato en el RVLM sobre la respuesta de RSNA a la estimulación neuronal MLR → RVLM (20 Hz) en ratas macho anestesiadas que expresan ChR2-GFP (n = 6). Flechas: ubicaciones de puntas de pipeta para inyecciones de RVLM. Los datos se analizaron mediante ANOVA RM unidireccional de Friedman por rango (ya que no se pasó la prueba de normalidad o de igual varianza) seguido de la prueba post hoc de Dunnett (d) o de una prueba t pareada de dos caras (e). La información estadística, incluidos los valores estadísticos F/t/χ2 y los grados de libertad, se presenta en la Tabla complementaria 15. *P < 0,05 frente a la línea de base promediada de 30 s. #P < 0,05 frente a los valores promediados de 1 s inmediatamente antes de cada fotoestimulación en 30 intervenciones. Los valores de referencia para los paneles d y e se informan en las Tablas complementarias 2 y 4, respectivamente. Los datos mostrados son medias ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Las imágenes de la sección del cerebro utilizadas en las figuras (a, e) se adaptaron de "Paxinos G & Watson C. The rat brain in stereotaxic coordenadas. 6th edn. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)".

a Estimulación optogenética de neuronas MLR → RVLM en ratas descerebradas no anestesiadas. b Una grabación representativa durante la estimulación optogenética (40 Hz) en una rata descerebrada que expresa ChR2-GFP. c, d Cursos de tiempo después de superponer y promediar el análisis (c intervalos de 100 ms) y durante las intervenciones optogenéticas (d intervalos de 10 s) de ∆RSNA y ∆VRNA en respuesta a la estimulación intermitente de 1 min de las neuronas MLR → RVLM en ChR2 -expresando ratas macho descerebradas (n = 6). e Efecto de los bloqueos de los receptores de glutamato en el RVLM sobre las respuestas de ∆VRNA y ∆AP a la estimulación sostenida de 15 s de neuronas MLR → RVLM (40 Hz), evaluadas por sus valores integrados durante 15 s, en machos descerebrados que expresan ChR2-GFP ratas (n = 6). Los datos se analizaron mediante ANOVA de RM unidireccional/ANOVA de RM unidireccional de Friedman por rango seguido de la prueba post hoc de Dunnett (c, d) o mediante una prueba t pareada bilateral (e). La información estadística, incluidos los valores estadísticos F/t/χ2 y los grados de libertad, se presenta en la Tabla complementaria 15. *P < 0,05 frente a la línea de base promediada de 30 s. #P < 0,05 frente a los valores promediados de 1 s inmediatamente antes de cada fotoestimulación en 30 intervenciones. Los valores de referencia para los paneles (c, d) y (e) se informan en las Tablas complementarias 5 y 7, respectivamente. Los datos mostrados son medias ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. La imagen de la sección del cerebro utilizada en la figura (a) se adaptó de "Paxinos G & Watson C. The rat brain in stereotaxic coordenadas. 6th edn. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)".

Debido a que las neuronas MLR → RVLM expresan VGLUT2 en sus terminales axonales (Fig. 1h) y muchas neuronas RVLM expresan receptores ionotrópicos de glutamato34, examinamos si la transmisión glutamatérgica en el RVLM contribuye a la simpatoexcitación mediada por neuronas MLR → RVLM. La respuesta de RSNA a la estimulación optogenética intermitente de 1 minuto (a 20 Hz) de las neuronas MLR → RVLM se probó 10 a 20 minutos después de las inyecciones bilaterales en el RVLM con solución salina (50 nL) o una mezcla de ácido 2-amino-5-fosfonovalérico y cianquixalina (AP5/CNQX; 10 mM en solución salina; 50 nL). En comparación con el tratamiento con solución salina, el tratamiento con AP5/CNQX condujo a una disminución del 23 % de la respuesta de RSNA provocada optogenéticamente, según lo evaluado por los valores de AUC para los cambios de RSNA (Fig. 2e; Fig. 3b complementaria). A los 60 min después del tratamiento con AP5/CNQX, la respuesta de RSNA se recuperó al 90 % de la respuesta después de los tratamientos con solución salina (P = 0,58; prueba t pareada bilateral). En conjunto, estos resultados indican que la transmisión glutamatérgica en el RVLM contribuye a la señalización MLR → RVLM que impulsa la simpatoexcitación renal.

Dado que las neuronas MLR glutamatérgicas desempeñan un papel importante en la evocación de la locomoción33,35,36,37, cuestionamos si la excitación de las neuronas MLR → RVLM provoca no solo la simpatoexcitación sino también la excitación de las motoneuronas, es decir, la activación del comando central. Para investigar esta posibilidad, registramos simultáneamente descargas en fibras nerviosas eferentes simpáticas y somatomotoras periféricas en ratas descerebradas, no anestesiadas y paralizadas. En esta preparación, mientras que la pérdida de inhibición de los circuitos corticotalámicos conduce a una hiperactividad del tronco encefálico, es ventajoso que se puedan descartar los efectos de la anestesia y la retroalimentación del movimiento. Las ratas descerebradas, en las que las neuronas que proyectan RVLM expresaron ChR2-GFP, recibieron pulsos de láser al MLR unilateralmente de manera intermitente durante 1 min como se indicó anteriormente (salida de láser de 20 mW; Fig. 3a). La estimulación optogenética de las neuronas MLR → RVLM elevó la PA sin efectos significativos sobre la FC y aumentó las descargas en las fibras nerviosas de la raíz ventral L5 simpática y somatomotora renal38 (Fig. 3b). En particular, la forma de descarga de estas fibras nerviosas durante las intervenciones optogenéticas difería; la simpatoexcitación renal (RSNA) se provocó de inmediato y sincrónicamente con cada serie de pulsos de iluminación de 0,5 s, mientras que la actividad nerviosa de la raíz ventral (VRNA) se elevó gradualmente y se mantuvo durante las intervenciones de 1 min (Fig. 3b-d). Los aumentos sostenidos en VRNA son consistentes con los de estudios previos, que examinaron el efecto de la estimulación eléctrica del MLR en ratas descerebradas21 y gatos39. Tales diferencias en las características de las respuestas de descarga neuronal simpática y somatomotora sugieren que los circuitos meduloespinales entre las neuronas MLR → RVLM y las neuronas motoras espinales desempeñan un papel como filtro de paso inferior, mientras que distintos circuitos meduloespinales corriente abajo de la vía MLR → RVLM median la rápida respuesta simpática. respuestas nerviosas. En contraste con la activación mediada por ChR2 de las salidas motoras simpáticas y somáticas, la iluminación en los controles que expresan EGFP no provocó cambios en el VRNA (Figuras complementarias 3c, d).

Usando ratas descerebradas, también probamos si la excitación de motoneuronas y las respuestas cardiovasculares provocadas por la estimulación de las neuronas MLR → RVLM involucran la neurotransmisión glutamatérgica en el RVLM. Las inyecciones bilaterales de AP5/CNQX en el RVLM redujeron significativamente la activación de VRNA y la elevación de AP en respuesta a la fotoestimulación sostenida de 15 s de las neuronas MLR → RVLM en un 64 y un 34 % (evaluado a través de la integración de los cambios de VRNA y AP durante la estimulación de 15 s). período), respectivamente, en comparación con aquellos después de las inyecciones de solución salina (Fig. 3e; Fig. 3e complementaria). Las respuestas de VRNA y AP se recuperaron 60 min después del tratamiento con AP5/CNQX en un 105 y un 81 % de las respuestas después del tratamiento con solución salina (P = 0,62 y 0,16; prueba t pareada bilateral; n = 3), respectivamente. Por el contrario, la estimulación optogenética no tuvo ningún efecto sobre la FC (Fig. 3e complementaria). En conjunto, las neuronas MLR → RVLM excitadas aumentan concomitantemente los tonos vasoconstrictores simpáticos y somatomotores en parte a través de la transmisión glutamatérgica en el RVLM.

La activación impulsada por la vía MLR → RVLM de los sistemas nerviosos simpático y somatomotor nos llevó a investigar si la estimulación de esta vía provoca tanto actividades locomotoras como cambios cardiovasculares autonómicos como se observa en el ejercicio de carrera. Las ratas en las que las neuronas que proyectan RVLM expresaron ChR2-GFP o controlan EGFP a través de inyecciones bilaterales de AAVrg en el RVLM se sometieron a iluminación MLR a través de fibras ópticas y su AP se controló con un telémetro de presión en condiciones de movimiento libre. Las ratas conscientes se colocaron en una pista circular (ID100 y OD140 cm), y cuando estaban descansando pero no durmiendo o moviéndose (p. ej., acicalándose), los cuerpos celulares de las neuronas MLR → RVLM se iluminaron bajo registros continuos de AP, HR y comportamientos. (Fig. 4a-c).

a Estimulación optogenética de neuronas MLR → RVLM en ratas conscientes que se dejan libres para moverse en una pista circular. b Transducción de GFP en las fibras axonales de la médula de una rata que expresa ChR2-GFP (autofluorescencia). Barras de escala: 1 mm. c Células inmunorreactivas a GFP y ChAT en el mesencéfalo. Asteriscos: una ubicación de la punta de fibra óptica implantada. Barras de escala: 1 mm. d Grabación representativa durante una intervención optogenética sostenida de 15 s (40 Hz; 20 mW) en una rata consciente que expresa ChR2-GFP. e Cambios en el curso del tiempo (contenedores de 3 s) en respuesta a la estimulación optogenética sostenida de 15 s (n = 8, además de n = 7 para la estimulación bilateral, todos los hombres). Los trazados de cada rata se presentan en la Fig. 4a complementaria. f Grabación representativa durante intervenciones optogenéticas intermitentes cinco veces repetidas (5 s con láser activado/5 s con láser desactivado) (40 Hz; 20 mW) en una rata consciente que expresa ChR2-GFP. Flechas: desconexión de las señales de telemetría. Este registro se incluyó en los resultados porque la desconexión se produjo después de las intervenciones optogenéticas. g Cambios en el curso del tiempo (contenedores de 5 s) durante estimulaciones optogenéticas cinco veces repetidas (n = 8, además de n = 7 para estimulación bilateral). Los trazados de cada rata se presentan en la Fig. 4c complementaria. Los datos se analizaron mediante ANOVA RM unidireccional/ANOVA RM unidireccional de Friedman por rango seguido de la prueba post hoc de Dunnett [e, g]. La información estadística, incluidos los valores estadísticos F/t/χ2 y los grados de libertad, se presenta en la Tabla complementaria 15. *P < 0,05 frente a la línea de base promediada de 15 s. Las vistas aéreas durante las grabaciones que se muestran en los paneles (d) y (f) se informan en las películas complementarias 1 y 2, respectivamente. Los valores de referencia para los paneles (e) y (g) se informan en las Tablas complementarias 8 y 9, respectivamente. Los datos que se muestran son la media ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. La imagen de la sección del cerebro utilizada en la figura (a) se adaptó de "Paxinos G & Watson C. The rat brain in stereotaxic coordenadas. 6th edn. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)".

La iluminación unilateral de cuerpos celulares de neuronas MLR → RVLM que expresan ChR2-GFP durante 15 s con luz láser azul pulsada a 40 Hz (salida láser de 20 mW) aumentó inmediatamente AP y provocó taquicardia tardía. A lo largo del período de estimulación, la fotoestimulación también provocó la locomoción o la carrera de todo el cuerpo sin impedir la capacidad de frenar o girar (Fig. 4d, e; Fig. 4a complementaria; Película complementaria 1). Además, intervenciones optogenéticas unilaterales cinco veces repetidas en las que un ciclo consistía en 5 s de encendido y 5 s de láser apagado a 40 Hz (20 mW) también provocaron respuestas presoras y respuestas taquicardiacas y locomotoras subsiguientes, que fueron fielmente sincrónico con cada ronda de pulsos de iluminación de 5 s (Fig. 4f, g; Fig. 4c complementaria; Película complementaria 2). Las distancias que las ratas caminaron/corrieron y las respuestas cardiovasculares durante estas fotoestimulaciones (evaluadas por integración durante el período de estimulación) dependieron de la frecuencia entre 10, 20 y 40 Hz (a 20 mW) y de la intensidad entre 10, 20 y 35–40 mW (a 40 Hz) (Fig. 4b, d complementaria). La estimulación optogenética bilateral provocó respuestas locomotoras y cardiovasculares similares a las causadas por la estimulación unilateral (Fig. 4e, g). Sin embargo, la iluminación MLR en los controles que expresan EGFP no provocó cambios de locomoción o cardiovasculares (Fig. 5 complementaria). Estos resultados demuestran que las neuronas MLR → RVLM excitadas impulsan tanto la locomoción como las respuestas cardiovasculares, lo que respalda la noción de que las señales de comando central transmitidas a través de la vía MLR → RVLM desempeñan un papel en la coordinación de los movimientos de las extremidades locomotoras y los controles cardiovasculares autónomos necesarios para el ejercicio de carrera.

La estimulación optogenética de cuerpos celulares neuronales MLR → RVLM no provocó taquicardia en ratas anestesiadas o descerebradas (Figs. 2, 3), probablemente porque el RVLM controla predominantemente la actividad vasomotora simpática en lugar de las funciones cardíacas25,26,27,28. Mientras tanto, esta estimulación en ratas conscientes aumentó la FC (Fig. 4). La respuesta taquicardiaca podría ser secundaria a la respuesta locomotora. La activación del reflejo basado en el músculo esquelético (es decir, el reflejo presor del ejercicio) debido al movimiento o la contracción de los músculos de las extremidades en ratas conscientes debería estar involucrada en la respuesta de FC40. También es probable que la estimulación de la vía MLR → RVLM active posteriormente otros circuitos centrales que a su vez provoquen respuestas cardiovasculares. Por ejemplo, el MLR regula el estado cortical en paralelo con la locomoción41.

También examinamos si otra vía simpatoexcitatoria que proyecta RVLM media la locomoción. El núcleo paraventricular hipotalámico (PVN) contiene una gran cantidad de neuronas que proyectan RVLM, de las cuales la estimulación selectiva en ratas anestesiadas provoca la simpatoexcitación42. Descubrimos que la estimulación optogenética de la vía PVN → RVLM en ratas conscientes y que se movían libremente aumentó AP pero nunca provocó la locomoción (Fig. 6 complementaria). Por lo tanto, a diferencia de la vía MLR → RVLM, la vía simpatoexcitatoria PVN → RVLM no está involucrada en el control motor somático de la locomoción.

Para examinar la necesidad de las neuronas MLR → RVLM en la integración motora somático-autonómica para las actividades locomotoras, probamos si la inhibición de esta vía durante el ejercicio de carrera voluntaria atenúa tanto la actividad locomotora como las respuestas cardiovasculares. Para inhibir optogenéticamente las neuronas MLR → RVLM, combinamos el sistema de expresión dependiente de Cre con AAV anterógrados y retrógrados para transducir selectivamente las neuronas MLR → RVLM con un iChloC canalrodpsina conductor de cloruro fusionado con mCherry o eYFP de control; Luego, el MLR se iluminó bilateralmente con pulsos de láser azul43 (Fig. 5a). iChloC-mCherry o eYFP se expresó en el 79 ± 5% de las neuronas MLR que expresan Cre (n = 10 ratas, en las que la inmunotinción de Cre fue exitosa; Fig. 5b). Los axones marcados con iChloC-mCherry/eYFP se distribuyeron abundantemente en el RVLM, en el que los terminales axonales se oponían a las neuronas RVLM C1 (Fig. 5c), lo que sugiere contactos sinápticos entre las neuronas marcadas MLR → RVLM y las neuronas RVLM C1.

a Inhibición optogenética de neuronas MLR → RVLM de ratas conscientes libres para moverse en una jaula que contiene una rueda de platillo volador. b Expresión de iChloC-mCherry dependiente de Cre en neuronas MLR → RVLM. Asterisco: ubicación de la punta de fibra óptica. Barras de escala: 1 mm (izquierda); 20 micras (derecha). c Distribución de axones inmunorreactivos de mCherry en la médula (izquierda); las hinchazones se oponían estrechamente a las dendritas y cuerpos celulares neuronales RVLM C1 (asteriscos; derecha). Barras de escala: 1 mm (izquierda); 10 micras (derecha). d Velocidad locomotora representativa y cambios cardiovasculares en respuesta a la inhibición optogenética de 2 s durante el funcionamiento de la rueda en una rata que expresa iChloC-mcherry. WRR, tasa de rotación de la rueda. La vista aérea durante la grabación se informa en la película complementaria 3. e Cambios en el curso del tiempo (contenedores de 200 ms) en respuesta a la intervención optogenética de 2 s durante la ejecución en controles que expresan eYFP (n = 4) y ratas macho que expresan iChloC-mCherry (n = 7). Gray, datos individuales promediados sobre ensayos. f Comparaciones entre controles (45 ensayos/4 ratas) y ratas que expresan iChloC-mCherry (96 ensayos/7 ratas): ∆WRR y ΔMAP integrados durante 5 s después del inicio de la intervención optogenética de 2 s durante la carrera. El nivel de preiluminación se determinó como un valor medio durante el período de 2 s inmediatamente anterior a la iluminación con láser. Barras horizontales, valores medios. g Gráficas de ∫ ΔMAP vs. ∫ΔWRR en cada prueba en curso. Muchas parcelas de ratas que expresan iChloC-mCherry distribuidas en el tercer cuadrante. h Comparaciones de porcentajes de prueba entre controles y ratas que expresan iChloC-mCherry y entre patrones de ∫ ΔWRR y ∫ ΔMAP. i Comparación entre controles (39 ensayos/4 ratas) y ratas que expresan iChloC-mCherry (69 ensayos/7 ratas) de ∫ ΔMAP en reposo. Los datos se analizaron mediante ANOVA RM unidireccional seguido de la prueba post hoc de Holm-Sidak o ANOVA RM unidireccional de Friedman por rango seguido de la prueba post hoc de Dunnett (e), prueba t de Welch bilateral (f), prueba RM ANOVA seguido de la prueba de Tukey (h) o la prueba U de Mann-Whitney (i). La información estadística, incluidos los valores estadísticos F/t/χ2 y los grados de libertad, se presenta en la Tabla complementaria 15. * P < 0,05 frente al nivel de preiluminación promediado de 2 s inmediatamente antes de la intervención optogenética (e). †P < 0,05 frente a todos los demás ensayos en cada grupo (h). ‡P < 0.05 vs. controles en cada patrón (h). Los valores de referencia para los paneles (e–h) e (i) (= nivel de preiluminación) se informan en las Tablas complementarias 13 y 14, respectivamente. Los datos mostrados son medias ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. La imagen de la sección del cerebro utilizada en la figura (a) se adaptó de "Paxinos G & Watson C. The rat brain in stereotaxic coordenadas. 6th edn. (Amsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)".

A las ratas conscientes que estaban equipadas para la manipulación optogenética y las mediciones AP telemétricas se les permitió moverse libremente en una jaula en forma de cubo [45 × 45 × 40 (altura) cm] que contenía una rueda horizontal con un diámetro de 36 cm (Fig. 5a) . Durante la carrera espontánea sobre la rueda o en reposo sobre el suelo de la jaula, el MLR se iluminó bilateralmente durante 2 s con un láser pulsado de 50 ms (10 mW a 10 Hz)43. Se confirmó que este enfoque optogenético inhibía eficazmente la excitación neuronal MLR → RVLM mediante tinción inmunohistoquímica de Fos. La expresión de Fos se indujo en neuronas MLR → RVLM mediante la activación optogenética mediada por ChR2 de sus cuerpos celulares bajo anestesia, y esta expresión de Fos inducida se suprimió mediante la fotoactivación simultánea de iChloC en estas neuronas (Fig. 7 complementaria).

En cada rata con expresión de iChloC-mCherry o eYFP de control en neuronas MLR → RVLM, se realizaron experimentos durante 2 a 4 días, en los que la serie de pulsos de láser se realizó en total de 9 a 17 intentos durante la carrera y de 5 a 15 intentos en reposo. . Las intervenciones optogenéticas durante el funcionamiento voluntario de la rueda fueron seguidas por varios patrones de cambios de comportamiento, como volver a correr después de detenerse/desacelerar la carrera o pararse en la rueda después de dejar de correr, entre los ensayos en cada rata (Figura complementaria 8a; Película complementaria 3). Sin embargo, la probabilidad de que encontráramos el comportamiento de "recorrer" el período de 5 segundos después del inicio de la serie de pulsos láser de 2 segundos fue del 79% (50-100%, n = 4) para los controles que expresan eYFP, pero solo 14 % (0–33 %, n = 7) para ratas que expresan iChloC-mCherry (Figura complementaria 8b). Por el contrario, las probabilidades de que la actividad locomotora se suprimiera durante el período de 5 s fueron mayores para las ratas iChloC que para los controles (Fig. 8b complementaria); se observó correr con una pausa o desaceleración dentro del período de 5 s en el 37 % (13–57 %) de las pruebas de carrera en ratas iChloC, mientras que este patrón de comportamiento no se observó en ningún control. "Pararse en la rueda después de dejar de correr" a los 5 s después del inicio del pulso láser se observó en el 7 % (0-21 %) para los controles, pero en el 24 % (14-35 %) para las ratas iChloC. Además, se observó dejar la rueda en el suelo de la jaula dentro del período de 5 s en el 8-30 % de los ensayos en seis de las 7 ratas iChloC, mientras que 3 ratas de control nunca mostraron este comportamiento, además de un control que dejó la rueda en el 29 % de las ratas. los juicios

Al promediar los cambios en la tasa de rotación de la rueda (WRR) y los cambios cardiovasculares en todas las pruebas de carrera para cada rata, encontramos que la inhibición optogenética de las neuronas MLR → RVLM durante la carrera de la rueda ejercía efectos inhibidores sobre la actividad locomotora y la elevación AP sin afectar la FC (Fig. 5d–f). Dado que las reducciones de WRR y AP ocurrieron inmediatamente después del inicio de la iluminación y exhibieron una cinética de curso de tiempo similar en promedio (Fig. 5e; Fig. 8c complementaria), era poco probable que la locomoción suprimida fuera una causa de la reducción de AP o viceversa. Mientras tanto, en los controles que expresan eYFP, la serie de pulsos láser administrada durante la carrera no tuvo ningún efecto sobre la WRR o los cambios cardiovasculares en promedio (Fig. 5e yf, Fig. 8c complementaria). Finalmente, en el 20 % (0-31 %) de los ensayos para controles, pero en el 71 % (62-82 %) para ratas iChloC, se observaron disminuciones concomitantes en WRR y AP después de la intervención optogenética, independientemente de los patrones de comportamiento (Fig. 5g y h). Estos resultados indican que la neurotransmisión MLR → RVLM media la señalización de comando central que participa en la coordinación de la actividad locomotora y los controles cardiovasculares simpáticos durante el ejercicio de carrera.

Por el contrario, las series de pulsos láser administradas mientras las ratas estaban en reposo no tuvieron efecto sobre AP o HR en los controles o en las ratas que expresaban iChloC-mCherry (Fig. 5i; Fig. 9 complementaria). Por lo tanto, es poco probable que la vía monosináptica MLR → RVLM contribuya a la homeostasis cardiovascular basal.

Nuestros análisis neuroanatómicos funcionales y experimentos fisiológicos in vivo combinados con manipulación optogenética en ratas revelaron que las neuronas MLR transmiten señales excitatorias impulsadas por comandos centrales, al menos parcialmente glutamatérgicas, al RVLM que estimulan las salidas somatomotoras y simpáticas durante el ejercicio voluntario. La estimulación optogenética de la vía monosináptica MLR → RVLM provocó respuestas cardiovasculares locomotoras y autonómicas como se observa en el ejercicio de carrera. Además, la inhibición selectiva de la vía MLR → RVLM suprimió la actividad locomotora y redujo la respuesta presora durante el funcionamiento voluntario de la rueda, pero no afectó la homeostasis cardiovascular basal en condiciones de reposo. En general, estos hallazgos demuestran que la vía subcortical MLR → RVLM constituye un componente clave del mecanismo del circuito central que transmite señales de comando volitivas centrales y, por lo tanto, media la coordinación del control cardiovascular autónomo y el control de las extremidades somatomotoras, que se requiere para mejorar el rendimiento de la locomoción. o correr ejercicio.

Junto con la vía MLR → RVLM, el RVLM también recibe proyecciones del PAG, como se muestra en la Fig. 1c. Aunque el PAG parece constituir otro circuito subcortical para el comando central19, se desconoce si las neuronas PAG que proyectan RVLM participan en la regulación autonómica durante el ejercicio y merece más estudio.

Mientras que los sistemas de control somatomotor y autonómico se han considerado tradicionalmente dispares44, los comportamientos primitivos de los vertebrados, incluidos el ejercicio, la locomoción, la alimentación, el sueño, la reacción de lucha, huida o congelación y el reflejo del dolor, se caracterizan por la coordinación somatomotora y regulación autonómica45,46,47. Por lo tanto, la arquitectura funcional del cerebro probablemente subyace en la fina coordinación de las actividades somatomotoras y autonómicas para comportamientos específicos, aunque actualmente su organización es poco conocida. En posible relevancia para este circuito, los trazados transneuronales dobles en ratas revelaron la presencia de poblaciones neuronales con conexiones a los sistemas motores tanto somáticos como simpáticos en regiones discretas en todo el cerebro48,49,50. Además, la estimulación eléctrica o química de un área del hipotálamo o del mesencéfalo provocó simultáneamente cambios somatomotores y cardiovasculares en animales y humanos13,14,15,17,18. Regiones que han sido previamente investigadas neuroanatómica o funcionalmente, como PVN50, MLR15,49, RVLM y núcleo paragigantocelular lateral (LPGi) en la formación reticular medular caudal48 entre otros13,14,15,17,18,48,49,50, pueden participan en la integración motora somático-autonómica y por lo tanto afectan diferentes comportamientos. Sin embargo, no se han explorado los roles causales de estas regiones en los comportamientos, así como la conectividad cerebral subyacente a estos roles. En el presente estudio, identificamos la vía MLR → RVLM como un mecanismo central subyacente a la integración motora somático-autonómica para el ejercicio de carrera voluntaria. En consecuencia, nuestro estudio proporciona una visión clave de la arquitectura cerebral para el acondicionamiento fisiológico necesario para maximizar el rendimiento del ejercicio.

La vía MLR → RVLM parece constituir una conexión clave a través de la cual las señales de comando central volitivas para la locomoción o el ejercicio voluntario de carrera afectan los sistemas nervioso somatomotor y simpático. Como lo demuestran los diferentes patrones de descargas nerviosas somatomotoras y simpáticas provocadas por la estimulación de neuronas MLR → RVLM (Fig. 3b-d), las señales excitatorias de esta vía parecen impulsar distintas vías meduloespinales que se conectan a las motoneuronas espinales y las neuronas preganglionares simpáticas. Sin embargo, la organización intrínseca para vincular funcionalmente la vía MLR → RVLM con actividades locomotoras o respuestas cardiovasculares simpáticas no ha sido clara. Sin embargo, nuestro estudio de rastreo indica que las neuronas postsinápticas a las que se dirige la vía glutamatérgica MLR → RVLM incluyen neuronas RVLM C1 (Figs. 1h y 5c), aunque las neuronas RVLM no C1 también pueden ser un objetivo de esta vía. Tanto las neuronas C1 como las no C1 en el RVLM envían proyecciones axonales a las neuronas preganglionares simpáticas en la médula espinal24. Las señales de comando central a través de la vía MLR → RVLM probablemente aumentan las salidas vasomotoras simpáticas a través de estas neuronas premotoras simpáticas RVLM.

Con respecto a la conectividad postsináptica de las neuronas MLR → RVLM para la regulación del sistema nervioso somatomotor, observamos que la locomoción no puede iniciarse mediante la estimulación no selectiva de las neuronas RVLM en roedores conscientes51,52, y esta opinión también está respaldada por la falta de efecto de la simpatoexcitación PVN → RVLM estimulación neuronal en el comportamiento de las ratas (Fig. 6 complementaria). Por lo tanto, la locomoción impulsada por las neuronas MLR → RVLM parece requerir la activación de una subpoblación especializada de neuronas RVLM, que está controlada específicamente por esta vía monosináptica y activa los circuitos locomotores meduloespinales ejecutivos. Los intermediarios clave entre las neuronas MLR → RVLM y las neuronas locomotoras espinales pueden incluir neuronas LPGi glutamatérgicas. Capelli et al.35 demostraron que la ablación condicional de esta población neuronal suprimió la locomoción provocada por neuronas glutamatérgicas MLR en ratones transgénicos VGLUT2-Cre, lo que sugiere que las neuronas glutamatérgicas LPGi desempeñan un papel modulador en la sintonía positiva de la locomoción mediada por neuronas glutamatérgicas MLR. El RVLM investigado en nuestros experimentos se coloca continuamente caudolateralmente al LPGi investigado por Capelli et al. tumbado rostrocaudalmente en el borde caudal del núcleo facial según los datos morfológicos de los estudios previos35 y nuestros (basados ​​en la distribución de las neuronas C1 y las áreas del cerebro para la transducción de AAV/implantación de la cánula óptica), así como el cerebro estándar de ratón y rata atlas Como tanto el RVLM como el LPGi son partes de la formación reticular medular, que se caracteriza por la estructura interconectada y la red expansiva de tractos, las neuronas MLR → RVLM pueden tener contactos sinápticos con una población neuronal específica del RVLM que regula las neuronas glutamatérgicas del LPGi y/u otras neuronas. neuronas locomotoras meduloespinales. También es posible que las neuronas del LPGi que controlan el aparato locomotor se entremezclen en la parte medial del RVLM; pueden estar controlados postsinápticamente por neuronas MLR → RVLM. En general, mientras que las señales de comando centrales que descienden a través de las neuronas MLR → RVLM regulan el sistema nervioso simpático a través de la activación de las neuronas RVLM simpatorreguladoras, las señales pueden estimular de manera colateral otra población neuronal RVLM, que a su vez activa una red de circuitos meduloespinales distinta que incluye el LPGi para la locomoción. Se requieren más investigaciones para determinar con precisión los mecanismos separados del circuito aguas abajo de las neuronas MLR → RVLM para las actividades locomotoras y las respuestas cardiovasculares simpáticas.

La locomoción es un representante de varios comportamientos voluntarios, incluidos el escape, la persecución y la exploración, que son provocados por diferentes voliciones motoras. No está claro si la vía MLR → RVLM, que desempeña un papel esencial en el ejercicio de carrera voluntaria, también participa en otras conductas locomotoras. No obstante, la activación del MLR ciertamente contribuye a la locomoción para el escape53 y la persecución54. Caggiano et al.36 también sugirieron que las neuronas CnF glutamatérgicas que reciben proyecciones de la sustancia gris periacueductal soportan la locomoción rápida requerida para escapar, mientras que las neuronas PPTg glutamatérgicas, que reciben proyecciones de los ganglios basales, pueden ser necesarias para la locomoción exploratoria lenta. Por lo tanto, la vía MLR → RVLM puede constituir un nodo clave común que subyace al acoplamiento somatomotor-autonómico para estos tipos de comportamiento locomotor, aunque puede recibir entradas aferentes de distintos circuitos impulsados ​​por diferentes voliciones motoras. Aunque actualmente se carece de evidencia, los circuitos ascendentes que influyen en la actividad de las neuronas MLR → RVLM para el ejercicio de carrera voluntaria pueden incluir regiones cerebrales relacionadas con la motivación interna, como el sistema orexinérgico hipotalámico55 y/o el núcleo accumbens56, los cuales tienen proyecciones axonales hacia el MLR33,57. Además, aunque la estimulación del área motora suplementaria, el área premotora o la corteza motora provoca contracciones musculares junto con simpatoexcitación en sujetos humanos16, no hay información disponible sobre conexiones corticales-subcorticales para transmitir señales de comando central. Además, mientras que se especula que el comando central se origina en el telencéfalo como "irradiación cortical"2, no hay consenso sobre el sitio que sirve como origen de las señales de comando central58. Los circuitos ascendentes que transmiten señales de comando centrales a las neuronas MLR → RVLM merecen una mayor investigación sobre los mecanismos cerebrales que subyacen a los ajustes cardiovasculares autónomos durante el ejercicio voluntario, un tema pendiente durante más de un siglo1,2 (Figura complementaria 10).

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal (ref#: 15-Y-40, 18-Y-11, 19-Y-53) y el Comité de Seguridad del Experimento de Recombinación Genética (ref#: 28-034, 31-067, 32-061) de la Universidad de Tottori. En este estudio se utilizaron ratas Sprague Dawley (Slc:SD; macho y hembra) de Japan SLC, Inc; se compraron a Shimizu Laboratory Supplier Co, Ltd y se criaron en nuestras instalaciones. Todas las ratas se mantuvieron en una habitación con aire acondicionado a 25 °C con un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h. Se alojaron en jaulas estándar, excepto las ratas para experimentos para estudiar el efecto de la inhibición optogenética a través de la activación de iChloC, que se alojaron (después del destete) en jaulas que contenían una rueda de platillo volador (36 cm de diámetro; Nutrición exótica). Se dispuso de agua y alimentos ad libitum. Todos los experimentos in vivo se realizaron en el laboratorio con aire acondicionado a 25 °C.

Los AAV para transducir anterógradamente las neuronas MLR con ChIEF-tdTomato (AAV2/1-CMV-ChIEF-tdTomato) y con palGFP (AAV2/1-CMV-palGFP) bajo un promotor de CMV (el casete del gen que codifica ChIEF-tdTomato fue donado por R McQuiston: Addgene#32846) y para la transducción dependiente de Cre de neuronas MLR → RVLM con iChloC-mCherry (AAV2/5-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry) (el casete de genes que codifica iChloC-mCherry fue donado por P. Hegemann: Addgene#85467) se han descrito previamente43,59,60. La producción y purificación de estos AAV siguió el protocolo Gene Transfer Targeting and Therapeutics Core modificado en Salk Institute (http://vectorcore.salk.edu/protocols.php). Los plásmidos necesarios se transfectaron en células HEK293T y el AAV se purificó a partir de un lisado bruto de las células utilizando OptiPrep (Axis-Shield). Después de la concentración a través de un filtro de membrana (Amicon Ultra-15 NMWL 50 K, Merck), las titulaciones finales fueron 2,1 × 1011 GC/mL (AAV2/1-CMV-ChIEF-tdTomato), 3,5 × 1011 GC/mL (AAV2/1 -CMV-palGFP) y 3,4 × 1012 GC/mL (AAV2/5-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry). Todos los demás AAV se obtuvieron de Addgene (AAVrg-hsyn-EGFP, donado por B. Roth: Addgene#50465, 7,4 × 1012 GC/mL; AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP, donado por E. Boyden: Addgene# 58800, 8,0 × 1012 GC/mL, AAVrg-pgk-Cre, donado por P. Aebischer: Addgene#24593, 9,5 × 1012 GC/mL, AAV, AAV2-Ef1a-DIO-EYFP, donado por K. Deisseroth: Addgene# 27056, 3,0 × 1012 GC/mL, AAV5-EF1a-DIO-ChR2-eYFP, donado por K. Deisseroth: Addgene#35509, 1,0 × 1012 GC/mL). Los plásmidos y los AAV con los números de Addgene proporcionados aquí se obtuvieron mediante acuerdos de transferencia de material con Addgene.

Se colocaron ratas (>6 semanas de edad) anestesiadas con isoflurano al 1-5% en oxígeno, intubadas y ventiladas artificialmente (SN480-7, Shinano) en una unidad de cabeza estereotáxica (900LOS de David Kopf Instruments, Inc., o SR-6R de Narishige). Se inyectó CTb o una solución de AAV administrada en el sitio del cerebro de interés mediante el uso de un sistema de microinyección a presión calibrado (Nanoject II, Drummond Scientific Co.). Para las inyecciones en el RVLM, se expuso la superficie dorsal del bulbo raquídeo mediante una incisión en la línea media realizada a través de la piel que cubre la parte posterior de la cabeza, seguida de una disección de los músculos que recubren la base del cráneo y luego una incisión realizada a través del atlanto -Membrana occipital. Las coordenadas para las inyecciones de RVLM (1,0 mm rostral y 1,8 mm lateral al calamus scriptorius; 3,5–3,7 mm ventral a la superficie dorsal del bulbo raquídeo) correspondieron a las ubicadas aproximadamente caudalmente al polo caudal de los núcleos faciales. Para las inyecciones en el MLR (8,0 mm caudal, 2,0 mm lateral y 6,3–6,9 mm ventral al bregma), se expuso el cráneo mediante una incisión en la línea media de la piel y se hicieron dos agujeros de trepanación en el cráneo. Las soluciones inyectadas en el cerebro fueron las siguientes: CTb conjugado con Alexa-555 (1,0 mg/1 ml de PBS, C34776, Thermo Fisher Scientific) (23,0 nL × 4, RVLM), AAV-CMV-ChIEF-tdTomato (46,0 nL × 4, MLR), AAV-CMV-palGFP (46,0 nL × 4, MLR), AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry (46,0 nL × 4, MLR), AAV-Ef1α-DIO-EYFP (46,0 nL × 4, MLR), AAV-Ef1α-DIO-ChR2-eYFP (46,0 nL × 4, MLR), una mezcla de AAV-Ef1α-DIO-ChR2-eYFP y AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry (1:1, 46,0 nL × 4, MLR), AAVrg-hsyn-EGFP (23,0 nL × 3, RVLM), AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP (23,0 nL x 3, RVLM) y AAVrg-pgk-Cre (23,0 nL × 3 , RVLM). Después de las inyecciones, la micropipeta permaneció insertada durante 5 min antes de retirarla.

En ratas inyectadas con CTb, se permitió un período de recuperación de 7 a 11 días hasta que se sometieron a perfusión transcardial. A las ratas inyectadas con AAV utilizadas en experimentos para examinar la expresión de Fos en las neuronas que proyectan RVLM se les permitió un período de recuperación de 7 días antes de que comenzara el programa de entrenamiento con ejercicios en cinta rodante. En las ratas inyectadas con AAV utilizadas para experimentos optogenéticos bajo estados anestesiados o descerebrados, se permitió un período de al menos 14 días antes de los experimentos. Procedimientos de inyección de AAV para ratas en experimentos conscientes seguidos de una cirugía adicional para implantar intracranealmente cánulas de fibra óptica (diámetro central de 200 μm, CFML52U-20, Thorlab). Se insertaron verticalmente en el cerebro dos fibras ópticas para la iluminación bilateral del MLR (8,0 mm caudal, 2,0 mm lateral y 5,5–5,8 mm ventral al bregma) a través de dos orificios perforados en el cráneo y se aseguraron junto con los tornillos colocados rodeando los agujeros con cemento dental. Para la iluminación unilateral del PVN, también se insertó una fibra verticalmente (1,9 mm caudal, 0,3 mm lateral y 7,9–8,2 mm ventral al bregma) y se aseguró. A las ratas utilizadas en experimentos conscientes se les permitió más de 7 días antes de someterlas a otra cirugía para implantar un telémetro de presión inalámbrico para mediciones AP (TRM54P, Millar, Inc./Kaha Sciences), que se describe a continuación.

En ratas anestesiadas con isoflurano, intubadas y ventiladas mecánicamente, se realizó una incisión abdominal en la línea media para exponer la cavidad peritoneal y luego se hizo una disección roma para llegar a la aorta descendente. Durante la oclusión temporal de la aorta con una seda 2-0 en la bifurcación ilíaca y debajo de la bifurcación de la arteria renal izquierda, se insertó el sensor de presión del telémetro en la aorta, se avanzó 1-2 cm rostralmente y se fijó con malla quirúrgica y Pegamento quirúrgico biocompatible. Después de liberar la oclusión de la aorta, se cerró con suturas la incisión en la piel. Los experimentos en ratas conscientes se realizaron al menos 1 semana después de la implantación del telémetro.

Para estudiar inmunohistoquímicamente las excitabilidades de la vía MLR → RVLM mediante el ejercicio de carrera voluntaria, ratas macho, que habían recibido inyecciones bilaterales en el RVLM con AAVrg-hsyn-EGFP, fueron entrenadas en cinta rodante 3-4 veces por semana y durante un total de 14–18 días. El primer día de entrenamiento, las ratas se colocaron en una cinta rodante hecha a medida con una rejilla de descarga eléctrica instalada en la parte trasera (MK-680C; Muromachi) durante al menos 30 minutos. Luego fueron sometidos a un ejercicio de carrera en cinta rodante a 10 m/min y una inclinación de 0˚ durante 1 min, que fue seguido inmediatamente por un período de 30 s de sonido de zumbador (1 Hz) como disparador para el inicio del ejercicio. Esta sesión se repitió de 3 a 5 veces para que las ratas aprendieran la asociación entre el sonido del zumbador y el inicio del ejercicio. Después del segundo día de entrenamiento, las ratas habían sido sometidas a una sesión de carrera por día. La velocidad y la duración de la carrera se incrementaron gradualmente durante 10 días hasta 20 m/min y 40 min, respectivamente. Después de completar el ejercicio en cinta rodante a 20 m/min durante 40 min una vez, las ratas se sometieron a ejercicio de carrera en cinta rodante a 16 m/min durante 40 min para las sesiones de entrenamiento restantes. Si el ritmo de carrera caía por debajo de la velocidad de la cinta rodante durante cada sesión de entrenamiento, se proporcionaría a las ratas una estimulación eléctrica leve pero aversiva del pie con la rejilla de choque. Sin embargo, a las ratas se les administraron muy pocas descargas porque recibieron un empujón suave con un hisopo de algodón cuando estaban a punto de tocar la rejilla. En consecuencia, estas ratas completaron el programa de entrenamiento y se volvieron capaces de correr voluntariamente en la cinta rodante a 16 m/min durante 40 min sin recibir choques ni empujones. Se permitió un período de dos días sin entrenamiento entre el último día de entrenamiento y el día del protocolo.

En el día del protocolo, las ratas se eligieron aleatoriamente como grupo "Ejercicio" y "Control". Las ratas de ejercicio se llevaron a la cinta rodante, en la que nunca se habían administrado descargas en los pies, y mantuvieron un período de descanso de 15 minutos. Posteriormente, después del período de sonido del zumbador durante 30 s, fueron sometidos a un ejercicio en cinta rodante de 40 min a 16 m/min. Los empujones fueron innecesarios durante este ejercicio en cinta rodante ya que las ratas corrieron durante todo el período sin acercarse a la parte trasera de la cinta. Las ratas de Control no ejercitadas se llevaron a la cinta rodante pero no se sometieron a ejercicio. Noventa minutos después de la compensación del ejercicio o del período de control, las ratas se anestesiaron profundamente mediante la inhalación de isoflurano al 5% en oxígeno y luego se perfundieron transcardiacamente de inmediato (como se describe más adelante).

Para las cirugías para medir las actividades de los nervios periféricos y los parámetros cardiovasculares, la rata fue anestesiada con isoflurano al 1-5% en oxígeno, intubada y ventilada mecánicamente. Se cateterizaron la arteria y la vena femorales derechas para medir la AP a través de un transductor de presión (P23XL, Becton, Dickinson & Co.) y para infundir fármacos, respectivamente. Se colocaron dos electrodos de aguja en las extremidades anteriores para registrar el ECG a partir del cual se calculó la frecuencia cardíaca utilizando el tiempo entre ondas R sucesivas. La rata se colocó en la unidad de cabeza estereotáxica. Para medir RSNA, el riñón izquierdo se expuso retroperitonealmente a través de una incisión en el flanco izquierdo y luego se conectó un haz de fibras nerviosas renales a un electrodo bipolar hecho de alambre de acero inoxidable. Para medir L5 VRNA, se realizó una laminectomía para exponer la porción lumbar inferior de la médula espinal y una incisión de las capas meníngeas que rodean la médula. El haz de nervios obtenido de la raíz ventral L5 izquierda se aisló cuidadosamente y se colocó en un electrodo de acero inoxidable bipolar aislado y luego se cortó y ligó el haz distal al electrodo. Las descargas de la raíz ventral de L5 reflejan actividades de las motoneuronas dirigidas al músculo esquelético de las patas traseras61, ya que las raíces ventrales caudales a L3 en ratas no transportan axones de neuronas preganglionares simpáticas38. Las señales RSNA y VRNA se amplificaron mediante un amplificador AC (MEG-5200; Nihon-Kohden) con un filtro pasabanda de baja frecuencia de 150 Hz y un filtro de alta frecuencia de 1 kHz para que fueran audibles. Los tejidos neurales expuestos se sumergieron en aceite mineral.

Las ratas para los experimentos bajo anestesia recibieron administración intravenosa de uretano (600 mg/kg) y α-cloralosa (60 mg/kg). En ratas para experimentos en condiciones de descerebración sin anestesia, se ligaron arterias carótidas bilaterales para minimizar la hemorragia cerebral durante el procedimiento de descerebración. Después de una craneotomía parietal, el cerebro se seccionó coronalmente con un bisturí a nivel precolicular. Se aspiró todo el tejido neural rostral a la sección y los tejidos corticales que cubren el cerebelo.

Para enviar luz láser a la región objetivo, se utilizaron cánulas de fibra óptica, que se conectaron a un láser de estado sólido bombeado por diodos de longitud de onda de 473 nm (BL473T8-200; Shanghai Laser and Optic, Co.) controlado por un generador de impulsos ( SEN-7103; Nihon Kohden o STOmk-2; BRC Co.) a través de un latiguillo de fibra óptica mono o ramificado se insertaron en el cerebro. Antes de la inserción, se midió la intensidad de salida del láser en la punta de cada cánula con un medidor (LPM-100; BRC Co.). Para la iluminación RVLM bilateral, se insertaron dos cánulas en el tronco encefálico en un ángulo vertical a la superficie dorsal del tronco encefálico (1,0 mm rostral y 1,8 mm lateral al calamus scriptorius) con puntas de cánula ubicadas a 3,0–3,2 mm rostroventral de la superficie. Para la iluminación de la MLR, las puntas de las cánulas se insertaron perpendicularmente en el cerebro (8,0 mm caudal, 2,0 mm lateral y 5,5–5,8 mm ventral al bregma en ratas anestesiadas no descerebradas; 0,2–0,5 mm rostral y 2,0 mm lateral al borde de los colículos inferior y superior, y a 3,5 mm ventral a la superficie dorsal de los colículos en ratas descerebradas). Después de que se completaron todos los procedimientos quirúrgicos, se eliminó el isoflurano de la rata. Se dejó pasar al menos 60 minutos antes de que comenzaran los protocolos experimentales.

En ratas anestesiadas con uretano que respiraban espontáneamente, que habían recibido inyecciones bilaterales en el MLR con AAV-CMV-ChIEF-tdTomato o AAV-CMV-palGFP, el RVLM se iluminó bilateralmente con láser a 20 o 40 Hz con pulsos de 5 ms durante 30 s. La potencia del láser se preestableció a 10 mW cuando se iluminó continuamente. En ratas anestesiadas con uretano o descerebradas que habían recibido inyecciones bilaterales en el RVLM de AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP o AAVrg-hsyn-EGFP, 1 min intermitente (iluminación de pulso de 0,5 s con un intervalo de 1,5 s ; 30 turnos) o fotoestimulación sostenida de 15 s del MLR a 10, 20 o 40 Hz con un pulso de láser de 5 ms (salida de potencia de láser de 10 mW en ratas anestesiadas y 20 mW en ratas descerebradas). Las ratas descerebradas fueron paralizadas preliminarmente por infusión intravenosa de bromuro de pancuronio (0,5 mg/kg de peso corporal). Durante la recopilación de datos, la frecuencia de ventilación mecánica se fijó en 70 respiraciones/min, que no estaba sincronizada con la de la fotoestimulación periódica (0,5 s con láser encendido y 1,5 s con láser apagado). Esto se llevó a cabo para aleatorizar el posible efecto del flujo de salida simpático arrastrado por la inflación pulmonar en las respuestas de RSNA a la fotoestimulación periódica21,61. El orden de la frecuencia de estimulación fue aleatorio y se permitieron intervalos de al menos 10 min entre maniobras.

Una mezcla de antagonistas del receptor de glutamato ionotrópico, ácido 2-amino-5-fosfonopentanoico (AP5; A5282; Merck) y 6-ciano-7-nitro-quinoxalina-2,3-diona soluble en agua (CNQX; ab120044; Abcam) (10 mM cada uno en solución salina) se inyectó bilateralmente al RVLM para inhibir la transmisión glutamatérgica en el RVLM. Las inyecciones se realizaron con el sistema de microinyección NANOJECT II por vía transcraneal a través de agujeros de trepanación realizados en el cráneo (12,5 mm caudal, 1,8 mm lateral y 10,5–10,8 mm ventral al bregma) o a través de la superficie dorsal del bulbo raquídeo como se indicó anteriormente. Después de las inyecciones bilaterales de solución salina o AP5/CNQX (46,0 nl/sitio), la duración de la fotoestimulación fue de 5 a 20 min.

Una vez que se completó la recopilación de datos, las cánulas de fibra óptica y/o las micropipetas se insertaron y retiraron repetidamente del cerebro para hacer cicatrices para la confirmación post hoc de las ubicaciones de las puntas. El nervio renal y el haz de la raíz ventral se cortaron entre el electrodo y el eje neural para medir el ruido de fondo de RSNA y VRNA, respectivamente. Las ratas se anestesiaron profundamente con una infusión intravenosa adicional de uretano y α-cloralosa o inhalación de isoflurano al 5% en oxígeno, después de lo cual se sometieron a perfusión transcardial como se describe más adelante.

Ratas macho que habían recibido inyecciones bilaterales en el RVLM con AAVrg-hsyn-EGFP o AAVrg-hsyn-ChR2-GFP y se les habían implantado cánulas de fibra óptica, así como un transmisor de telemetría, se sometieron a experimentos para observar cambios en AP, HR ( calculado a partir de ondas AP), y el comportamiento en un estado consciente cuando el MLR o PVN se iluminó con láser a través de las cánulas. Antes del día experimental, se permitió que las ratas se movieran libremente durante 1 a 1,5 h en una pista circular y se acostumbraran al entorno experimental. Los diámetros interior y exterior de la pista eran de 100 y 140 cm, mientras que las alturas de las paredes interior y exterior eran de 30 y 40 cm, respectivamente. La pared interior estaba hecha de polietileno envuelto en cloruro de polivinilo negro, mientras que la pared exterior estaba hecha de tablero acrílico transparente. El suelo de la pista estaba hecho de láminas de goma de superficie lisa, de color verde oscuro o negro.

En el día experimental, las cánulas de fibra óptica para la iluminación MLR se conectaron a un láser de estado sólido bombeado por diodo de longitud de onda de 473 nm a través de un cable de conexión de fibra óptica mono o ramificado de 1,5 m, 1 × 1 rotativo de fibra óptica empalme y latiguillo FC-FC. La potencia de salida del láser para la iluminación MLR se ajustó preliminarmente con otras cánulas de fibra óptica que tenían la misma eficiencia de transmisión del láser que las cánulas implantadas. Se dejó que la rata consciente se moviera libremente en la pista circular y se dejaron pasar al menos 30 minutos antes de que comenzaran los experimentos. En la rata en reposo (que no dormía ni se movía activamente, como caminar o acicalarse), el MLR se iluminó unilateral o bilateralmente con pulsos de láser de 5 ms a 10, 20 o 40 Hz después de recopilar datos de referencia durante 15 s. Los pulsos de luz se administraron de manera sostenida durante 15 s, o de manera intermitente de manera repetitiva cinco veces durante 5 s con láser con un intervalo de 5 s. En otras ratas utilizadas para estudiar el efecto de la excitación neuronal PVN → RVLM, el PVN también se iluminó con láser unilateralmente. En aquellos casos en los que se produjo la desconexión de las señales de telemetría durante las intervenciones optogenéticas durante más de 1 s, los datos fueron descartados. En los casos de desconexión durante > 1 s después de intervenciones optogenéticas (p. ej., Fig. 4f), los datos se incluyeron en los análisis. En cada rata en un día experimental, se realizaron de 2 a 6 ensayos en orden aleatorio, y se permitieron intervalos de al menos 10 min entre ensayos. Los días experimentales estaban separados por al menos 2 días.

Ratas macho o hembra anestesiadas con isoflurano que habían recibido inyecciones bilaterales en el RVLM con AAVrg-hsyn-EGFP y en el MLR con AAV-Ef1a-DIO-eYFP, AAV-Ef1a-DIO-ChR2-eYFP o una mezcla de AAV- Ef1a-DIO-ChR2-eYFP y AAV-Ef1a-DIO-iChloC-mcherry fueron ventilados mecánicamente y canulados a través de una vena femoral. Las puntas de fibra óptica se insertaron en el cerebro para iluminación MLR (4,5 mm ventral a bregma). Posteriormente, bajo anestesia con infusión intravenosa de uretano y α-cloralosa, el MLR se iluminó bilateral e intermitentemente (10 s encendido/10 s apagado, 90 veces) durante 30 min con láser azul pulsado de 50 ms (10 mW, 10 Hz). Cuarenta y cinco minutos después de la compensación de la iluminación, los animales se perfundieron transcardiacamente con paraformaldehído al 4% y luego se tomó el cerebro para tinción inmunohistoquímica para marcar la expresión de Fos como se describe a continuación.

Ratas macho juveniles (de 4 a 6 semanas de edad) se alojaron en grupo en jaulas de vidrio acrílico que contenían una rueda de platillo volador de 36 cm de diámetro (Exotic Nutrition). En consecuencia, se mostraron dispuestos a correr espontáneamente sobre la rueda cuando fueron sometidos al estudio. Después de alcanzar la madurez (>9 semanas de edad), estas ratas recibieron inyecciones bilaterales en el MLR con AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry o AAV-Ef1a-DIO-EYFP y en el RVLM con AAVrg-pgk-Cre, y fueron implantado con cánulas de fibra óptica y un transmisor de telemetría (como se describe anteriormente). El experimento se realizó durante la fase oscura. En el día experimental, las cánulas de fibra óptica se conectaron al láser a través de los cables de conexión y la junta rotatoria, y la potencia de salida para la iluminación MLR se preestableció en 10 mW.

Después de dejar que la rata consciente deambulara libremente en una jaula en forma de cubo hecha de vidrio acrílico [45 × 45 × 40 (altura) cm] que contenía la rueda del platillo volador, se dejó pasar un período de al menos 30 minutos antes de comenzaron los experimentos. Se instalaron cuatro pequeñas protuberancias en el borde de la rueda a intervalos regulares; estos eran levemente contactables con una barra que se colocó en la jaula y se conectó a un transductor de fuerza (FT03; Grass Instruments) a través de un resorte. En consecuencia, la tasa de rotación de la rueda (WRR) fue calculada con intervalos de tiempo entre los eventos de desarrollo de tensión debido a los contactos entre las protuberancias y la barra. Mientras la rata corría voluntariamente sobre la rueda o descansaba (sin dormir ni moverse, por ejemplo, acicalándose) en el suelo, el MLR se iluminó bilateralmente durante 2 s con pulsos de 50 ms a 10 Hz43. La iluminación durante la carrera comenzó al menos 2 s después del inicio de la carrera espontánea. En un día, se realizaron aleatoriamente de 5 a 13 pruebas en reposo o durante la carrera para cada rata con intervalos de al menos 5 minutos permitidos entre pruebas. Los días experimentales para cada rata estaban separados por al menos dos días.

Las ratas anestesiadas profundamente con una infusión intravenosa adicional de uretano o la inhalación de isoflurano al 5 % en oxígeno se perfundieron transcardiacamente con solución salina heparinizada seguida de paraformaldehído al 4 % en solución salina tamponada con fosfato 0,1 M (PBS; pH 7,4). Los cerebros se extrajeron, se fijaron posteriormente en el mismo fijador a 4 °C durante 2 h y luego se transfirieron a una solución de sacarosa al 30 % a 4 °C durante 24–48 h. Utilizando un criostato (CM1900, Leica, Wetzlar, Alemania o HM505 E, GMI, Ramsey, MN, EE. UU.), se produjeron secciones de cerebro coronal o sagital de 30 μm de espesor.

Para la tinción de inmunofluorescencia, las secciones de tejido se lavaron en PBS (2 lavados × 10 min) y se incubaron en una solución de anticuerpos (PBS que contenía Triton X-100 al 0,3 %, 2,5 g/L de carragenina lambda, 200 mg/L de NaN3, 10 mL/ L suero de burro normal) durante 2 h a temperatura ambiente. Luego, las secciones se incubaron en una solución de anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, después de enjuagar las secciones en PBS que contenía Triton X-100 al 0,03 % (2 × 10 min), se incubaron en la solución de anticuerpo secundario en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente y luego se enjuagaron nuevamente en PBS ( 2 × 10 min) en la oscuridad. Finalmente, las secciones se montaron en portaobjetos y se cubrieron con medio de montaje líquido (P36930; Thermo Fisher Scientific). Las imágenes digitales de las secciones teñidas se capturaron con un microscopio digital (BZ-9000 o BZ-X710; Keyence) o un microscopio confocal (LSM780; Carl Zeiss).

Los anticuerpos primarios utilizados fueron los siguientes: anti-tirosina hidroxilasa de pollo (1:500; ab76442, Abcam), anti-colina acetiltransferasa de cabra (1:100 o 1:200; AB144P, Merck), anti-GFP de cabra (1:1000 ; GTX26673, GeneTex, Irvine, CA, EE. UU.), cabra anti-tdTomato (1:500; AB8181, Sicgen), ratón anti-Cre Recombinase (1:1000; MAB3120, Merck), conejo anti-c-Fos (1: 400; 2250s, Cell Signaling Technology), anti-GFP de conejo (1:1000; A-6455, Invitrogen), anti-RFP de conejo (1:1000; 600-401-379, Rockland), anti-tirosina hidroxilasa de conejo (1 :1000; AB152, Merck), y transportador de glutamato antivesicular de conejo 2 (1:500; AF860, Frontier Institute). Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios (especie huésped, burro): DyLight 405 anti-pollo (1:250; 703-475-155, Jackson ImmunoResearch), Alexa Fluor 488 anti-pollo (1:500; 703-545-155, Jackson ImmunoResearch), Alexa Fluor 405 anticabra (1:500; ab175665, Abcam), Alexa Fluor 488 anticabra (1:500; ab150129, Abcam), Alexa Fluor 555 anticabra (1:500; A-21432, Thermo Fisher Scientific o ab150130, Abcam), anti-ratón Alexa Fluor 488 (1:500, ab150109, Abcam), anti-ratón Alexa Fluor 555 (1:500; ab150106, Abcam), anti-conejo Alexa Fluor 488 (1: 500; A-21206, Thermo fisher Scientific o ab150073, Abcam), y anti-rabbit Alexa Fluor 555 (1:500; ab150074, Abcam).

Para el mapeo celular y el recuento en el mesencéfalo, se estudiaron secciones coronales a 8,0 mm caudal desde el bregma. Los niveles rostrocaudales de las secciones se validaron con referencia a puntos de referencia apropiados, como el acueducto cerebral, la sustancia gris periacueductal, las raíces sensoriales del nervio trigémino, el pedúnculo cerebeloso superior y los núcleos del colículo superior e inferior. La distribución de células marcadas con CTb en el mesencéfalo se investigó en ocho ratas. En tres de las ocho ratas, también se investigó la distribución de células inmunorreactivas a ChAT. Las células inmunorreactivas marcadas con CTb y ChAT se mapearon en imágenes digitales de secciones originales antes de que se transcriban a secciones estándar proporcionadas por Paxinos y Watson62, nuevamente utilizando los puntos de referencia apropiados.

Para contar el número de células inmunorreactivas a Fos en GFP o poblaciones inmunorreactivas a ChAT en el MLR, se eligió un corte por rata al azar entre 2 y 4 cortes sucesivos. Las células inmunorreactivas se mapearon en imágenes digitales de secciones coronales originales como se describe anteriormente. El número de células mapeadas en CnF y PPTg, cuya extensión se definió de acuerdo con el atlas62 de cerebro de rata y por referencia a la distribución de células inmunorreactivas a ChAT, así como puntos de referencia apropiados, se contaron bilateralmente de manera doble ciego. .

Las imágenes de la sección del cerebro utilizadas en las figuras (Figs. 1a, c, e, i, 2a, e, 3a, 4a, 5a, Figs. complementarias 2a, 6a, 7a, 10) se crearon con referencia a las ilustraciones de Paxinos y Watson. atlas del cerebro de rata 62.

A lo largo de los experimentos optogenéticos in vivo, todas las mediciones analógicas se digitalizaron a través del sistema de adquisición de datos del convertidor AD (PowerLab 8/30 o 8/35; ADInstruments), se mostraron continuamente en un monitor de computadora y se registraron digitalmente a una frecuencia de muestreo de 1 kHz en un disco duro utilizando el software LabChart (v8.0 o 8.1.16; ADInstruments). MAP y HR se calcularon post hoc latido a latido y se volvieron a muestrear a 1 kHz. La vista aérea del experimento con ratas conscientes se capturó continuamente en video con una cámara web HD (C920; Logicool) conectada a una computadora, y los datos de video se almacenaron a una velocidad de 10 cuadros por segundo (fps).

En experimentos optogenéticos realizados en ratas anestesiadas o descerebradas, los valores de referencia se obtuvieron a partir de promedios de 15, 30 o 60 s antes de las intervenciones optogenéticas. También se determinaron los valores promedio de 1 s inmediatamente antes de cada período corto (0,5 s) de período de fotoestimulación durante el protocolo de estimulación intermitente de 1 minuto para examinar las respuestas de RSNA y VRNA a la fotoestimulación. En experimentos para estudiar los efectos de la estimulación optogenética a través de la activación de ChR2 en ratas conscientes, los valores de referencia se obtuvieron a partir de promedios de 15 s antes del inicio de la iluminación láser. En experimentos para estudiar el efecto de la inhibición optogenética a través de la activación de iChloC en ratas conscientes, los valores medios durante el período de 2 s inmediatamente anterior a la iluminación con láser se determinaron como referencia. Los valores de referencia se presentan en las tablas complementarias 1–14.

Para cuantificar las respuestas de RSNA y VRNA a la fotoestimulación, después de obtener señales rectificadas de onda completa de estas actividades nerviosas periféricas, así como señales de ruido de fondo, se restó el componente de ruido para RSNA o VRNA de la señal rectificada. Las respuestas de RSNA y VRNA a las intervenciones optogenéticas se cuantificaron como cambios relativos de los valores de referencia, que se indicaron como 100 %. Se realizaron procedimientos adicionales, es decir, análisis de superposición y promediación, para cuantificar RSNA y VRNA en respuesta a un período de fotoestimulación de 0,5 s durante un protocolo de estimulación intermitente de 1 min. Los cambios relativos en RSNA o VRNA desde la línea de base se volvieron a muestrear a 1 kHz en respuesta a cada período de fotoestimulación de 0,5 s, antes de superponerse entre sí y promediarse en el punto de tiempo (Fig. 2c). Los valores de AUC de los cambios promedio de RSNA también se calcularon como un índice de las respuestas de RSNA a la fotoestimulación al integrar los aumentos en los cambios de RSNA desde la línea de base durante el período de tiempo posterior al análisis de superposición y promedio (Fig. 2c).

Se grabaron videos a 10 fps durante los experimentos para estudiar el efecto de la estimulación optogenética en ratas conscientes; estos fueron analizados para calcular la velocidad locomotora utilizando un sistema de seguimiento de video de acuerdo con su manual (SMART ver. 3.0; Panlab). Para determinar el contorno de la rata en cada imagen de una secuencia de video, se utilizó como referencia una imagen del área experimental (pista circular) sin rata y se comparó con cualquiera de las imágenes de video durante el experimento que contenía la rata. La diferencia entre ambas imágenes fue entonces detectada por el sistema. Al detectar consecutivamente el centro de masa de la rata en cada imagen, se logró un seguimiento del movimiento de más de 200 ms. Posteriormente, se calculó la velocidad instantánea de la rata en la pista circular sin suavizar. Los videos grabados durante los experimentos para estudiar el efecto de la inhibición optogenética en ratas conscientes se usaron para validar los valores de WRR calculados usando el método descrito anteriormente.

Los datos se excluyeron de los resultados en los casos en que las inyecciones fallaron en la región objetivo, las puntas de las fibras ópticas se ubicaron de manera inadecuada, se produjo una desconexión de las señales de telemetría durante la estimulación optogenética durante más de 1 segundo o las ratas no estaban dispuestas a correr voluntariamente en la rueda.

Todas las medidas se exportaron en Excel (Microsoft). Todos los análisis estadísticos se realizaron en SigmaPlot 14.0 (Systat Software, Inc). Para las comparaciones entre grupos independientes, los datos se analizaron mediante la prueba t de Welch si tenían una distribución normal (evaluados mediante la prueba de Shapiro-Wilk) o mediante la prueba U de Mann-Whitney si no tenían una distribución normal. Para muestras pareadas entre ensayos, los datos se analizaron mediante pruebas t pareadas. Para muestras repetidas entre ensayos o cambios en el curso del tiempo, los datos se analizaron mediante ANOVA de medidas repetidas unidireccional (RM ANOVA) o mediante ANOVA RM unidireccional de Friedman por rango donde se suponía normalidad (prueba de Shapiro-Wilk) y/o varianza igual ( prueba de Brown-Forsythe) no se cumplieron en ANOVA. Para muestras repetidas entre ensayos entre grupos independientes, los datos se analizaron mediante ANOVA RM de dos vías. En su caso, estos procedimientos de ANOVA fueron seguidos por la prueba post hoc de Dunnett, Holm-Sidak o Tukey. Todas las pruebas fueron bilaterales. Las pruebas utilizadas para presentar cada gráfico en cifras y otra información estadística, incluidos los valores estadísticos F/t/χ2 y los grados de libertad, se presentan en la Tabla complementaria 15. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los datos se expresan como medias con errores estándar (SEM).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos asociados con este estudio se proporcionan en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Todo el código utilizado para analizar las respuestas simpáticas y cardiovasculares está disponible en OSF: https://osf.io/tuhgm/.

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Esta investigación fue apoyada por JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (21H03321) (SK); una subvención JSPS KAKENHI para investigación científica (B) (18H03151) (SK); una subvención JSPS KAKENHI para jóvenes científicos (A) (15H05367) (SK); una subvención JSPS KAKENHI para investigación desafiante (exploratoria) (20K21759) (SK); una subvención JSPS KAKENHI para investigación científica (C) (22K06470) (N.Ka.); una subvención JSPS KAKENHI para investigación científica (C) (19K06954) (N.Ka.); una subvención JSPS KAKENHI para investigación científica (B) (20H03418) (KN); por AMED (JP21wm0525002 a N.Ka.; JP21gm5010002 a KN); por JST Moonshot R&D (JPMJMS2023 a KN); y becas de la Takeda Science Foundation (SK). Agradecemos a Yui Yamane, Koji Maruyama, Atsuki Otake, Yumi Ono y Eri Hanai por su ayuda con los experimentos y el conteo celular manual doble ciego, así como a Tottori Bio Frontier administrado por la Prefectura de Tottori, Japón, por el uso de la microscopía confocal. sistema.

División de Fisiología Integrativa, Facultad de Medicina de la Universidad de Tottori, Yonago, Japón

Satoshi Koba, Nao Kumada, Emi Narai y Tatsuo Watanabe

División de Biociencia Integrativa, Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Tottori, Yonago, Japón

Kumada también

Departamento de Fisiología Integrativa, Facultad de Medicina de la Universidad de Nagoya, Nagoya, Japón

Naoya Kataoka y Kazuhiro Nakamura

Instituto de Investigación Avanzada de la Universidad de Nagoya, Nagoya, Japón

Naoya Kataoka

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SK concibió el estudio. SK y N.Ku diseñaron experimentos con aportes de N.Ka. y KNSK, N.Ka., KN y TW prepararon materiales de estudio. N. Ku. y SK realizaron experimentos y analizaron datos. Cifras preparadas por SK, N.Ku. y EN. SK, N.Ku. y KN analizaron los datos. SK y KN escribieron el manuscrito con aportes de todos los coautores.

Correspondencia a Satoshi Koba.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Koba, S., Kumada, N., Narai, E. et al. Vía excitatoria monosináptica del tronco del encéfalo que impulsa las actividades locomotoras y las respuestas cardiovasculares simpáticas. Nat Comun 13, 5079 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32823-x

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Recibido: 10 Septiembre 2021

Aceptado: 18 de agosto de 2022

Publicado: 29 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32823-x

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Investigación Clínica Autonómica (2022)

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